空间单细胞蛋白质组学PCF(CODEX)

发布时间：2025-06-03 18:42:03 阅读量：11 作者：生物检测中心

空间单细胞蛋白质组学PCF(CODEX)：核心检测项目深度解析

空间单细胞蛋白质组学技术PCF(CODEX) (Protein Co-Detection by indEXing) 通过创新的抗体标记与循环成像技术，实现了在完整组织切片中对数十种蛋白质的同时检测与空间定位分析。以下将重点解析其核心检测项目：

一、核心检测对象：蛋白质及其空间表达

  1. 检测靶标：蛋白质

    • 核心能力： 直接检测组织切片中特定蛋白质的表达水平与定位。
    • 目标类型： 主要针对细胞膜、细胞质、细胞核以及细胞外基质中的蛋白质。
    • 检测基础： 使用特异性的抗体（一抗）识别目标蛋白质。

  2. 多重检测能力 (Multiplexing)

    • 核心优势： CODEX的核心突破在于其超高多重检测能力。
    • 检测通量： 单次实验可稳定检测40-60种蛋白质，技术优化后可达100种以上。
    • 实现方式： 通过独特的“抗体-报告寡核苷酸”缀合物（CODEX抗体）实现。每种抗体连接独特的DNA条形码（Barcode）。

二、核心检测流程：循环成像与解码

  1. 样本制备：

    • 组织切片制备（如福尔马林固定石蜡包埋FFPE或冷冻切片）。
    • 抗体染色： 将数十种携带不同DNA条形码的CODEX抗体混合，同时孵育组织切片。所有目标蛋白在此时已被其特异抗体识别并结合。

  2. 循环成像与解码：

    • 核心原理： 利用少量荧光报告分子，通过多轮杂交、成像、淬灭循环，逐步读取每种抗体上的DNA条形码。
    • 检测步骤循环：
      1. 杂交： 加入与当前轮次对应的荧光标记解码寡核苷酸（与特定抗体的部分条形码互补）。
      2. 成像： 使用荧光显微镜（宽场或共聚焦）对整张切片进行成像，记录当前轮次的荧光信号位置。
      3. 淬灭： 移除荧光报告分子并淬灭荧光信号，为下一轮做准备。
    • 循环次数： 通常需要7-10轮循环才能完整解码所有抗体的条形码组合，从而识别出每个空间位置上存在的是哪种蛋白质。

  3. 数据生成：

    • 每一轮成像获得的是代表特定条形码组合（即特定抗体/蛋白质）在空间分布的图像。
    • 最终将所有轮次的图像进行解码和叠加，生成包含所有检测蛋白质（通常40-60种）表达信息的高维多通道图像。
    • 每个像素点或每个被识别的细胞都包含数十种蛋白质的表达强度信息。

三、核心检测输出：单细胞分辨率空间图谱

  1. 单细胞分辨率：

    • 成像分辨率可达亚细胞水平（约0.3微米/像素或更高）。
    • 结合细胞核染色和图像分析算法（如机器学习驱动的细胞分割），可精确界定单个细胞的边界。

  2. 空间位置信息：

    • 完整保留组织中每个细胞和蛋白信号的精确物理坐标。
    • 可分析细胞在组织微环境中的绝对位置和相对位置（例如，距离血管的距离，与其他特定细胞类型的邻近关系）。

  3. 多维度数据整合：

    • 蛋白质表达谱： 每个细胞有数十种蛋白质的定量表达数据（荧光强度）。
    • 细胞表型： 基于蛋白质表达模式对细胞进行聚类和分类，定义不同的细胞类型和细胞状态（如免疫细胞分型：T细胞亚群、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞；肿瘤细胞、基质细胞、内皮细胞等）。
    • 空间关系： 细胞与细胞之间的邻近关系、群落结构（如肿瘤免疫微环境中的三级淋巴结构）、空间梯度等。
    • 组织微环境： 描绘复杂的细胞生态系统，分析不同细胞类型在空间上的共定位、排斥或特定分布模式。

四、关键检测性能指标

  1. 多重性 (Plex)： 单次实验可检测的蛋白靶标数量（核心优势，40-100+）。
  2. 分辨率：
    • 空间分辨率： 成像系统分辨率，决定亚细胞结构的识别能力（通常亚微米级）。
    • 单细胞分辨率： 能否准确分割并获取单个细胞的数据（是CODEX的核心能力）。
  3. 灵敏度与特异性：
    • 灵敏度： 检测低丰度蛋白的能力，依赖于抗体亲和力、信号放大效率、背景噪音控制。
    • 特异性： 准确识别目标蛋白，最小化脱靶结合和交叉反应，依赖于抗体的质量。
  4. 定量准确性： 荧光信号强度能否线性反映目标蛋白的表达丰度。受抗体结合效率、标记效率、成像条件等多种因素影响，通常用于相对定量比较。
  5. 组织完整性： 整个多轮成像过程中组织形态结构的保持程度。
  6. 通量： 在单位时间内能完成成像和分析的组织区域大小或切片数量。

五、典型检测应用场景（项目目标）

  1. 肿瘤免疫微环境 (TIME) 分析：

    • 检测项目：免疫检查点蛋白 (PD-1, PD-L1, CTLA-4)、免疫细胞标记 (CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, FoxP3)、功能状态标记 (Ki-67, Granzyme B)、肿瘤细胞标记 (Pan-CK)、基质细胞标记等。
    • 目标：绘制TIME中免疫细胞的空间分布、活化状态、与肿瘤细胞的相互作用，寻找预后或治疗响应的生物标志物。

  2. 发育生物学：

    • 检测项目：发育关键信号通路蛋白、谱系特异性标记、形态发生相关蛋白。
    • 目标：揭示胚胎或器官发育过程中细胞命运决定、空间模式形成的分子机制。

  3. 神经科学：

    • 检测项目：神经元亚型标记、突触蛋白、胶质细胞标记 (GFAP, Iba1)、神经递质/受体。
    • 目标：解析复杂脑区中不同神经细胞类型及其连接的空间组织，研究神经退行性疾病或损伤后的变化。

  4. 感染与免疫：

    • 检测项目：病原体抗原、宿主免疫应答相关蛋白（炎症因子、免疫细胞标记）、组织损伤修复标记。
    • 目标：研究病原体在组织中的定位、免疫细胞浸润的空间动态、宿主-病原体相互作用。

  5. 器官结构-功能研究：

    • 检测项目：特定器官（如肝、肾、肠）中功能分区相关的关键蛋白、细胞类型标记、血管/淋巴管标记。
    • 目标：理解器官内不同功能单元的空间组织和细胞组成。

六、检测项目的优势与局限

  • 优势：
    • 超高多重： 核心优势，远超传统免疫荧光/组化。
    • 完整空间信息： 保留组织结构和细胞位置。
    • 单细胞分辨率： 提供细胞水平的蛋白表达和空间关系。
    • 标准化流程： 相对标准化的抗体标记和自动化成像流程。
    • 兼容性： 适用于广泛的组织类型（FFPE/冷冻）。
  • 局限：
    • 抗体依赖性与质量： 检测能力受限于高质量、已验证特异性抗体的可获得性。抗体交叉反应是潜在风险。
    • 非靶向性： 只能检测预先选定的目标蛋白，无法发现未知靶标。
    • 灵敏度限制： 对极低丰度蛋白的检测可能存在挑战。
    • 组织自发荧光干扰： 某些组织（如肝脏、脾脏）的自发荧光可能影响信噪比。
    • 复杂性与成本： 实验流程复杂，设备昂贵，数据分析计算量大。
    • 定量相对性： 主要用于相对定量比较，绝对定量较难。

总结：

空间单细胞蛋白质组学PCF(CODEX)的核心检测项目聚焦于在完整组织切片上，利用超高多重抗体标记（40-100+蛋白） 结合循环成像解码技术，实现在单细胞分辨率下对数十种蛋白质的表达进行精确定量，并完整保留其空间位置信息。它能够描绘出复杂的组织细胞图谱，揭示细胞类型、状态及其在空间上的相互作用网络，为理解发育、疾病（尤其是肿瘤免疫）、感染和组织稳态等生命过程提供了前所未有的视角。其核心价值在于将深度的单细胞蛋白组信息与至关重要的空间背景完美融合。然而，该技术也高度依赖高质量抗体库，且流程相对复杂昂贵。随着抗体库的扩展、成像技术的提升和生物信息学工具的进步，CODEX在空间生物学研究中的应用广度和深度将持续拓展。