重复性开放型涂抹试验：评估物质皮肤累积刺激性的标准方法
在化妆品、外用药品、化学品及洗涤用品的安全性评估中，了解物质对皮肤潜在的反复接触刺激性至关重要。重复性开放型涂抹试验（Repeated Open Application Test, ROAT）作为一种标准化、非侵入性的皮肤安全性测试方法，被广泛用于模拟日常使用场景，评估物质在多次连续使用后是否诱发皮肤累积性刺激反应或接触性致敏反应。
一、 试验定义与目的
- 定义： ROAT 是一种在皮肤特定区域（通常是前臂屈侧或上背部），以固定的剂量和频率，连续多日（通常为7天、14天或21天）重复涂抹受试物质的试验方法。每次涂抹后物质保持开放状态（不覆盖），模拟实际使用情况。
- 主要目的：
- 评估累积性皮肤刺激性： 检测物质在反复使用下是否引起进行性加重的红斑、水肿、干燥、脱屑、皲裂等刺激性反应。
- 辅助评估接触性致敏潜力： 虽然诊断接触性过敏主要依靠斑贴试验，但ROAT有时可用于模拟实际暴露模式，辅助识别可能的迟发型超敏反应（致敏）。阳性反应模式（如随时间进展加剧的湿疹样反应）可提供线索。
- 模拟实际使用条件： 比单次斑贴试验更能反映消费者或工作者在日常重复使用产品时的皮肤暴露情况。
- 支持产品安全声明： 为产品安全性评价提供关键数据，证明其在预期使用方式下对皮肤的低刺激性。
二、 试验原理
ROAT的设计基于以下核心原理：
- 累积效应： 某些物质单次接触可能不引起明显反应，但多次重复接触后，由于皮肤屏障功能逐渐受损、炎症介质持续积累或免疫反应的诱发，刺激反应可能叠加并显现或加重。
- 开放应用： 不同于封闭斑贴试验（可能放大反应），开放涂抹更贴近现实生活（如使用面霜、洗手液、清洁剂），减少了因封闭环境导致的汗液潴留、表皮过度水合等因素的影响，结果更具外推性。
- 动态观察： 通过每日观察评分，可以描绘出皮肤反应随时间发展的轨迹，清晰识别反应的出现、进展、平台或消退过程。
三、 试验方法要点
标准的ROAT流程通常包含以下关键步骤：
- 受试者筛选：
- 招募健康志愿者（通常18-65岁），需签署知情同意书。
- 排除标准：测试区域有皮肤病、活动性炎症、已知对受试物或其类似物过敏、孕妇或哺乳期妇女、近期使用免疫抑制剂或抗炎药物、过度日晒等。
- 皮肤类型需记录（如Fitzpatrick分型），可能影响反应表现。
- 筛选期（通常测试前1-2周）避免在预定测试区域使用外用药物或强烈护肤品。
- 测试区域准备：
- 常用部位：前臂屈侧（方便涂抹和观察），每侧可测试不同物质或浓度；上背部（如需测试多个样本）。
- 清洁：测试前用温和清洁剂和水清洁皮肤，晾干。
- 标记： 用防水记号笔精确标记出涂抹区域（通常为直径2-3cm的圆形区域，面积约3-4 cm²）。多个区域需保持足够间距（>4cm）。
- 受试物应用：
- 剂量： 使用微量注射器或校准过的移液器，精准涂抹固定量的受试物（通常为15-25 µl/cm²，例如在一个4 cm²区域内涂抹0.06-0.1ml）。确保覆盖整个标记区域。
- 频率： 每日两次（如早晚各一次）是最常用的方案，模拟典型的产品使用习惯。有时也采用每日一次（如某些特殊用途产品）。
- 手法： 轻柔涂抹，避免用力摩擦造成机械刺激。
- 对照： 通常在同一受试者另一对称部位或邻近区域涂抹阴性对照（如生理盐水、溶剂对照或公认温和的基础配方）。
- 开放状态： 涂抹后不覆盖敷料，允许自然干燥。受试者被告知在涂抹后至少30-60分钟内避免摩擦、冲洗或弄湿测试区域。
- 试验周期：
- 标准周期： 连续涂抹 7天、14天或21天。选择取决于测试目的、物质性质及潜在风险预估。14天是较为常用的折中方案。
- 灵活性： 对于已知刺激性较低的物质，7天可能足够；对于潜在风险较高或需要更严格评估的物质，21天能提供更全面的信息。
- 皮肤反应评估：
- 频率： 在每次涂抹前（约间隔12小时） 以及试验结束后24小时和48小时（或必要时更长时间）进行观察评估。首次评估通常在涂抹开始前（基线）。
- 评估者： 由经过培训的观察员（通常为皮肤科医生或经验丰富的研究人员）在标准光照下进行评估。
- 评估指标： 采用标准化的评分量表（常用Draize评分或其改良版本），主要评估：
- 红斑（发红）： 0（无）到4（严重红斑，可能伴有轻度紫癜）分。
- 水肿（肿胀）： 0（无）到4（严重水肿，隆起超1mm）分。
- 其他反应： 干燥、脱屑、皲裂、丘疹、水疱等也应记录描述。
- 记录： 详细记录每个测试区域每次观察的评分结果和任何主观症状（如瘙痒、刺痛、灼热感）。
- 提前终止标准：
- 出现明确的阳性反应（如红斑水肿评分≥2分且持续或加剧）。
- 出现水疱、剧烈疼痛、强烈瘙痒等提示严重刺激或过敏的反应。
- 受试者因任何原因要求退出。
- 发生任何不良事件（AE）或严重不良事件（SAE）。应立即终止该受试者该区域的涂抹，并对反应进行适当处理、记录和随访。
四、 结果解读与报告
- 数据分析：
- 计算每组（受试物组、对照组）在每次观察点的平均刺激分值（通常为红斑与水肿分值之和）。
- 绘制平均刺激分值随时间变化的曲线图，直观显示反应的累积趋势。
- 基于预先设定的标准（常参考试验方案或行业指南），判定受试物是否引起累积性刺激：
- 阴性： 所有受试者在整个试验期间，受试物区域的平均评分未超过对照组，且未观察到具有临床意义的刺激反应。
- 阳性（累积性刺激）： 受试物区域的平均评分显著高于对照组（统计检验如t检验），且/或在试验后期观察到评分持续升高或稳定在较高水平，达到预设的阳性判定阈值（例如，连续几天的平均分≥1或特定反应比例）。
- 可疑致敏反应模式： 若反应通常在后期（如第5天后）突然出现并快速加重（典型的湿疹样表现：红斑、丘疹、水疱、渗出），尤其是在低剂量下出现，则强烈提示接触性致敏而非单纯刺激。此类结果需要后续诊断性斑贴试验（如封闭斑贴试验）来确认。
- 报告内容： 完整报告应包括试验目的、受试物信息（匿名描述其性质）、受试者信息（人数、筛选标准）、试验方案（周期、频率、剂量、部位、评估方法）、详细结果（原始评分表、平均分图表、个体反应描述、照片证据）、不良反应记录、结果讨论（与预期和对照比较）、结论（受试物是否存在累积刺激性及强度评估）。
五、 优势与局限性
- 优势：
- 更贴近现实： 开放应用模式模拟日常使用场景，结果的预测价值更高。
- 识别累积效应： 是检测由反复暴露引起的低水平或渐进性刺激的理想方法。
- 辅助识别致敏： 能捕捉到封闭斑贴试验可能遗漏的某些致敏模式（尽管不是确诊工具）。
- 非侵入性： 相比某些体内测试创伤较小。
- 相对简便： 操作相对标准化，易于在临床研究机构开展。
- 局限性：
- 非诊断性： 阳性反应无法区分是累积刺激还是过敏（需结合临床和后续斑贴试验）。
- 敏感性限制： 对于非常轻微的刺激或罕见致敏原可能不够敏感。
- 受试者依从性： 依赖受试者严格按照要求在家自行涂抹，依从性差异可能影响结果。
- 外部干扰： 开放状态下皮肤暴露于环境因素（如摩擦、温度、湿度变化），可能引入干扰。
- 样本量限制： 通常样本量小于大样本流行病学研究，对低发生率事件的捕捉能力有限。
- 主观性： 皮肤反应评分存在一定主观性，需评估者经验培训和标准化。
六、 应用与伦理
- 主要应用领域：
- 化妆品和个人护理用品（护肤品、彩妆、洗发水、沐浴露等）的安全性评价。
- 外用药物（尤其是长期使用的药物如激素、抗真菌药、维A酸类）的皮肤耐受性评估。
- 家用和工业用化学品（清洁剂、消毒剂、涂料、胶粘剂、金属加工液等）的皮肤刺激性评估。
- 新原料或配方变更的安全性确认。
- 产品宣称（如“低刺激”、“适合敏感肌肤”）的支持性证据。
- 伦理与安全：
- 知情同意： 必须严格遵守伦理准则，确保受试者在充分理解试验目的、流程、潜在风险和获益后自愿签署知情同意书。
- 风险评估： 试验前需对受试物进行充分的安全性评估（如急性毒性、理化性质、现有皮肤刺激数据），确保受试者风险最小化。
- 研究者责任： 研究者需具备资质，能处理可能出现的皮肤反应。
- 不良事件监测与报告： 建立完善的AE/SAE监测、记录、处理和报告机制。
- 受试者补偿： 应给予受试者适当的补偿。
- 伦理委员会审批： 试验方案必须事先提交独立的伦理委员会审查并获得批准。
结论
重复性开放型涂抹试验（ROAT）是评估物质在模拟实际使用条件下反复接触皮肤后是否产生累积性刺激反应的关键工具。其开放应用的模式提供了优于封闭试验的真实性，能有效捕捉那些在单次或短期接触中不明显的渐进性皮肤不良反应。尽管其阳性结果需要结合临床判断和其他测试（如斑贴试验）来区分刺激与过敏，ROAT所提供的关于产品在预期使用频率下的皮肤耐受性信息，对于保障消费者安全、支持产品开发与合规至关重要。严谨的方案设计、标准的操作流程、客观的评估以及严格的伦理遵守，是确保ROAT结果科学可靠、受试者安全的核心要素。该试验在化妆品、外用药品及化学品的安全性评价体系中扮演着不可或缺的角色。