抗氧化（DPPH）功效测试

DPPH自由基清除实验：原理与方法详解

在抗氧化活性研究中，DPPH自由基清除能力测试因其简便、快速、稳定的特性，已成为评估物质清除自由基能力的重要标准方法。本文详细阐述其基本原理、操作步骤与结果解读。

一、基本原理

DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼基）是一种稳定的有机自由基化合物，其乙醇或甲醇溶液呈现深紫色（最大吸收波长约517 nm）。当物质具有提供氢原子或电子的能力时，能使DPPH自由基还原为无色的DPPH-H形式，导致溶液紫色褪去。

反应机制如下：

DPPH•（紫色） + H•（供体） → DPPH-H（无色）

溶液颜色褪色程度（吸光度下降幅度）与物质清除自由基的能力正相关，由此可定量评估其抗氧化活性。

二、实验材料与方法

1. 主要试剂与设备

• DPPH试剂： 精确称取DPPH粉末，溶于无水乙醇或甲醇（常用浓度：0.1-0.2 mM），避光低温保存。
• 待测样品溶液： 将待测物溶于适宜溶剂（常用水、乙醇、甲醇、DMSO等），配制成不同浓度梯度。
• 阳性对照： 常用抗坏血酸（维生素C）、Trolox（水溶性维生素E类似物）或BHT（丁基羟基甲苯）。
• 溶剂对照： 与样品溶剂一致的空白溶剂。
• 设备： 紫外-可见分光光度计、恒温水浴或恒温箱（可选项）、微量移液器、离心机（过滤法可替代）、避光容器。

2. 实验步骤详解

1. 溶液制备：

   • 配制新鲜DPPH工作溶液（如0.1 mM于无水乙醇）。
   • 配制系列浓度的待测样品溶液及阳性对照溶液（浓度范围需预实验确定）。
   • 配制溶剂对照溶液。

2. 反应体系建立：

   • 建议方法（混合法）： 在试管或96孔板中，精密加入一定体积（如2 mL或200 μL）的DPPH工作溶液。
   • 加入等体积的不同浓度的待测样品溶液（或阳性对照溶液）。
   • 空白对照： DPPH工作溶液 + 等体积溶剂。
   • 样品本底对照（重要）： 待测样品溶液 + 等体积纯溶剂（不含DPPH）。用于校正样品自身颜色干扰。
   • 涡旋振荡混匀。

3. 反应与测定：

   • 将混合溶液置于避光、室温（或特定温度如37°C）条件下反应（通常30分钟 - 2小时，需优化确定稳定时间点）。
   • 反应结束后，立即测定各管在517 nm波长下的吸光度（A）。
   • 若溶液浑浊，可在测定前短暂离心（如3000-5000 rpm，5分钟）或过滤（0.22 μm滤膜）。

3. 数据处理与分析

1. 计算自由基清除率（Scavenging Activity, SA）： 清除率 (%) = [1 - (A_sample - A_sample_background) / A_blank] × 100%

   • A_sample：待测样品 + DPPH 反应后的吸光度
   • A_sample_background：待测样品 + 纯溶剂（无DPPH）的吸光度（本底对照）
   • A_blank：DPPH + 溶剂（无样品）的吸光度

2. 计算IC₅₀值：

   • 以样品浓度（μg/mL或μM）为横坐标（X），清除率（%）为纵坐标（Y），绘制剂量-效应曲线。
   • 使用线性或非线性回归模型（如Logistic模型）计算清除率达到50%时对应的样品浓度，即为IC₅₀值。IC₅₀值越低，表明样品的DPPH自由基清除能力越强。

3. 结果表达：

   • 报告不同浓度样品的清除率。
   • 报告IC₅₀值及其95%置信区间（若适用），并注明计算方法。
   • 阳性对照的IC₅₀值应同时报告作为方法可靠性的参考。

三、结果解读与讨论要点

1. 活性评价： IC₅₀值是核心评价指标。通常IC₅₀ < 50 μg/mL被认为具有强抗氧化活性；50-100 μg/mL为中等活性；100-200 μg/mL为弱活性；>200 μg/mL则活性微弱或不明显。需结合阳性对照进行相对评价（例如，某提取物IC₅₀为40 μg/mL，VC为10 μg/mL，则其活性约为VC的1/4）。
2. 机制探讨： DPPH法主要反映物质通过**提供氢原子（HAT机制）**清除自由基的能力。显著活性提示样品富含酚羟基、胺基等易供氢基团（如酚酸、黄酮醇、某些生物碱）。
3. 阳性对照价值： 阳性对照（如VC、Trolox）不仅是质量控制的关键（确保实验体系正常），其IC₅₀值也为评估待测样品活性强度提供了绝对或相对（如Trolox当量）的标尺。
4. 相关性分析（拓展）： 可将DPPH活性与样品中总酚、总黄酮等含量进行相关性分析，探讨活性物质基础。

四、方法优势与局限性

优势：

• 操作简便快捷，无需复杂仪器或特殊条件。
• 试剂稳定易得，DPPH自由基稳定性好。
• 灵敏度较高，适用于多种类型样品（植物提取物、食品、合成化合物等）。
• 结果直观可靠（颜色变化肉眼可见），重现性良好。

局限性：

• 溶剂限制： DPPH易溶于有机溶剂（甲醇、乙醇），水溶性样品的测试需选用特殊配方或方法（如助溶、增溶），结果可能受影响。
• 光谱干扰： 样品自身若在517 nm附近有强吸收（有色物质），即使使用本底对照修正也可能引入误差。
• 反应特异性： 主要反映HAT机制活性，对单电子转移（SET）机制的敏感性较差。
• 并非生物体系模拟： DPPH是人工合成的稳定自由基，其清除能力不完全等同于在复杂生物体系（细胞、生物体内）中的实际抗氧化功效。
• 反应时间依赖性： 清除率随反应时间变化，需严格控制反应时间点。

五、应用领域

• 天然产物研究与开发： 快速筛选具有抗氧化潜力的植物、真菌、海洋生物等提取物或单体化合物。
• 食品科学与营养： 评估果蔬、谷物、油脂、功能性食品、饮料等新鲜度、加工稳定性和营养价值。
• 合成化学： 评价新型抗氧化剂分子的设计效果。
• 化妆品与护肤品原料评价： 筛选具有潜在抗皮肤氧化应激功效的成分。
• 药物研究（辅助）： 初步评估化合物清除自由基、缓解氧化损伤的潜力（需结合细胞和动物实验）。

结论

DPPH自由基清除实验是体外评估物质抗氧化活性的经典、高效方法。通过精确控制实验条件、规范操作流程并准确计算IC₅₀值，可有效比较不同物质的自由基清除能力强弱。其在天然产物、功能性食品、化妆品原料等领域具有广泛应用价值。然而，研究者需清醒认识其局限性，特别是反应机制特异性和非生理环境的限制。DPPH测试结果应作为抗氧化能力评价的重要组成部分，而非唯一标准，需结合其他体外模型（如ABTS⁺、FRAP、ORAC）以及更接近生理环境的细胞模型或动物实验进行综合判断，才能更全面地揭示物质的抗氧化功效。

重要提示： 本方法描述基于通用科学原理与常规操作。具体实验优化（如最佳DPPH浓度、反应时间、温度、溶剂选择）需根据待测样品的性质和实验目的进行探索和验证。