去屑（马拉色菌）功效测试 - 中析研究所生物检测中心

去屑功效的科学验证：聚焦马拉色菌的核心作用与控制

一、理论基础：头皮屑与马拉色菌的关系

马拉色菌的角色：
- 马拉色菌是健康头皮上天然存在的亲脂性酵母菌（真菌），依赖头皮分泌的皮脂（主要为三酰甘油）中的脂质成分生长。
- 它分泌脂酶，将皮脂分解为游离脂肪酸（FFA），特别是具有刺激性的饱和长链FFA（如油酸）。
头皮屑的成因：
- 个体敏感性差异：部分人群头皮屏障功能较弱或对马拉色菌代谢产物（特别是刺激性FFA）异常敏感。
- 微生态失衡：马拉色菌数量异常增多或比例失调（如限制性马拉色菌Malassezia restricta、球形马拉色菌Malassezia globosa通常被认为是主要相关菌种）。
- 炎症反应：刺激物诱导头皮角质形成细胞释放促炎因子（如IL-1α, IL-8, TNF-α），引发局部炎症。
- 表皮更新异常：炎症加速角质形成细胞增殖与迁移，导致角质层细胞过早、大量脱落（角化不全），形成肉眼可见的头皮屑（鳞屑）。

二、去屑功效的核心测试：抑制马拉色菌能力评估

功效测试需紧密结合上述致病机理，多层次验证产品抑制马拉色菌的能力。

(一) 体外抑菌测试 (In Vitro Antimicrobial Testing)

在严格控制的人工环境中，直接评估活性成分或配方对马拉色菌生长和活力的影响。

菌种选择与培养：
- 标准菌株：使用实验室保藏的、与头皮屑高度相关的马拉色菌标准菌株，最常见的是Malassezia globosa (球形马拉色菌) 和Malassezia restricta (限制性马拉色菌)。
- 临床分离株：有条件时可补充从头皮屑患者头皮分离的临床菌株，增加测试的临床相关性。
- 培养基：必须使用添加脂质（如橄榄油、吐温80等）的专用培养基（如Leeming & Notman培养基， Dixon改良培养基），以满足马拉色菌对脂质的生长需求。
- 培养条件：严格控温（通常32-37°C，模拟头皮温度），维持适当湿度。
关键抑菌实验方法：
- 最小抑菌浓度 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 测试：
  - 目的：确定活性成分或配方能够完全抑制目标马拉色菌肉眼可见生长的最低浓度。这是评价抑菌效力的金标准之一。
  - 方法：在含脂培养基中，配制一系列浓度梯度的待测物溶液（通常是2倍稀释系列）。加入定量菌悬液，孵育指定时间（通常7-14天）。肉眼观察或使用酶标仪测定菌液浊度/吸光度（OD值），判定无菌生长的最低浓度即为MIC值。MIC值越低，抑菌效力越强。
- 最小杀菌浓度 (Minimum Fungicidal Concentration, MFC) 测试：
  - 目的：确定活性成分或配方能够杀死目标马拉色菌（而非仅抑制其生长）的最低浓度。
  - 方法：通常继MIC测试后进行。将MIC及更高浓度的测试孔中的液体，取定量转移到新鲜的不含待测物的含脂培养基平板上，继续孵育。最终判定无菌落生长的最低浓度即为MFC值。MFC值有助于区分是抑菌还是杀菌作用。
- 琼脂扩散法 (Agar Diffusion Test)：
  - 目的：定性或半定量评估活性成分或配方在固体培养基中扩散抑制马拉色菌生长的能力。
  - 方法：将马拉色菌菌悬液涂布于含脂琼脂平板上。在平板上放置浸有待测物溶液的滤纸片（纸片法），或将待测物溶液加入预先打好的孔中（打孔法），或将含有待测物的样品膏体/溶液直接点样于平板表面。孵育后，测量抑菌圈（清晰透明环）的直径。抑菌圈越大，表明在该测试条件下的抑制能力越强。注意：此法更适合水溶性较好的物质，对难溶或油溶性活性物（如吡罗克酮乙醇胺盐、酮康唑）可能不适用或需特殊处理。
- 时间-杀菌曲线 (Time-Kill Kinetic Assay)：
  - 目的：动态评估活性成分或配方在不同时间点对马拉色菌的杀灭速率和程度，考察其杀菌动力学特征。
  - 方法：将目标马拉色菌暴露于特定浓度的待测物中，分别在暴露后不同时间点（如0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 24小时）取样，进行菌落计数（CFU/ml）。绘制CFU/ml随时间变化的曲线，分析杀菌速度和强度（如是否达到log3或log4级别的杀菌效果）。

(二) 体外抗生物膜测试 (In Vitro Anti-Biofilm Testing)

背景：马拉色菌能在头皮和毛发表面形成生物膜，生物膜状态的菌体对抗菌剂的抵抗力显著增强，可能是治疗失败或复发的原因之一。
方法：
- 生物膜形成能力评估：检测马拉色菌在不同材料（如模拟毛发的聚酯膜）上形成生物膜的能力（常用结晶紫染色法、XTT/MTT代谢活性检测法）。
- 生物膜抑制：评价待测物在生物膜形成过程中对其的抑制作用。
- 成熟生物膜清除：评价待测物对已形成的成熟生物膜的清除或杀灭效果（常用生物膜活力检测结合形态学观察如扫描电镜SEM）。

(三) 体外抗真菌代谢活性测试

脂酶活性抑制：马拉色菌分泌的脂酶是其致病的关键酶。评估活性成分或配方对马拉色菌脂酶活性的抑制能力（常用显色底物法），可作为控制其产生刺激性代谢产物的间接指标。

(四) 人体功效性临床试验 (In Vivo Clinical Efficacy Testing)

体外测试是基础，但最终验证必须在真实使用场景下进行。人体试验是评价产品整体去屑效果的核心环节。

受试者选择：
- 目标人群：招募中度至重度头皮屑问题的志愿者。
- 纳入标准：明确头皮屑严重程度（如基线头皮屑评分达标）、年龄范围、健康状况良好、特定时期内未使用其他去屑/抗真菌/药用洗发水等。
- 排除标准：排除头皮有其他炎症性疾病（如银屑病、脂溢性皮炎严重发作期）、严重系统性疾病、已知对测试成分过敏者、孕妇哺乳期妇女等。
- 知情同意与伦理审查：试验方案必须通过独立的伦理审查委员会批准，所有受试者签署书面知情同意书。
试验设计：
- 随机、双盲、安慰剂对照 (RDBPC)：黄金标准设计。受试者随机分配到测试产品组或安慰剂组（无活性去屑成分但基质相同的产品），受试者和研究人员（评估者）均不知分组情况。
- 分组与样本量：通常包含测试产品组、安慰剂对照组，有时会增加阳性对照组（已知有效去屑产品）。需足够的样本量以达到统计学效力。
- 试验周期：通常4-8周，包含基线期（第0天）、治疗期（如第2、4、6、8周随访）和可能的停药后随访期（观察持续性和复发情况）。
- 产品使用：明确规定使用频率（如每周2-3次）、用量、使用方法（如按摩头皮停留一定时间）和注意事项（如避免使用其他护发产品）。
核心评价指标：
- 头皮屑严重程度评分 (Adherent Scalp Flaking Score, ASFS)：由训练有素的研究人员/皮肤科医生在标准光照条件下，使用标准化分级量表（如0-10分等级量表）对头皮多个代表性区域的黏附性鳞屑进行视觉评估。这是最主要的客观终点指标。
- 头皮瘙痒评分：受试者根据标准化量表（如视觉模拟量表VAS 0-10）自我评估头皮瘙痒的严重程度。
- 马拉色菌计数（可选关键指标）：
  - 头皮取样：在基线及各访视点，使用标准方法（如胶带粘贴法、刮取法、洗脱法）采集头皮鳞屑/皮脂样本。
  - 定量检测：
    - 培养计数法：样本接种于含脂选择性培养基，孵育后计数菌落形成单位（CFU）。是传统的定量方法，但耗时长（7-14天），且马拉色菌可能不易培养。
    - 分子生物学方法 (PCR/qPCR/DNA测序)：提取样本总DNA，使用马拉色菌属或特异性菌种（如M. globosa, M. restricta）的引物进行定量PCR (qPCR) 或高通量测序。能快速、特异、定量地检测目标菌的载量（如菌落数/μg DNA 或相对丰度%）。qPCR是当前更常用且高效的方法。
- 头皮红斑/炎症评分：由评估者对头皮发红/炎症程度进行视觉评分。
- 整体改善评价：研究者整体评估（IGA）和受试者自评整体改善（SGA），使用Likert量表（如“显著改善”、“中度改善”、“无变化”、“恶化”）。
- 安全性评估：记录所有不良事件（如刺激、过敏、不适感）。
数据分析：
- 主要分析测试产品组与安慰剂组在主要终点指标（如第4周或第8周的ASFS评分、马拉色菌载量）上的组间差异是否具有统计学显著性（如p<0.05）。
- 分析测试产品组相对于基线的改善程度。
- 分析马拉色菌载量变化与头皮屑症状改善（如ASFS评分降低）之间的相关性（如Spearman秩相关）。
- 分析安全性数据。

(五) 仪器辅助评估

头皮影像分析：使用高分辨率的皮肤镜或专用头皮/毛发成像系统，记录头皮状态（鳞屑、红斑），可进行更客观的定量或半定量分析。
角质层状态检测：如胶带剥离结合生物物理参数检测（经皮水分散失TEWL、角质层含水量），评估头皮屏障功能改善情况。

三、整体测试体系的严谨性保障

标准化操作流程 (SOPs)：所有测试环节（从菌种培养、样本采集、检测方法到临床评估）均需严格遵守预先制定的、详细的SOPs，确保结果的可重复性与可比性。
质量控制 (QC)：在体外实验中包含阳性和阴性对照；在临床研究中确保评估者的一致性（如进行培训并通过一致性测试）。
统计学方法：根据试验设计选择合适的统计方法（如t检验、ANOVA、非参数检验、协方差分析ANCOVA等），并预先设定统计分析计划。
合规性：人体临床试验严格遵守《赫尔辛基宣言》原则、国际人用药品注册技术协调会（ICH）的GCP准则以及相关国家地区的法规要求。

结论

针对以控制马拉色菌为核心机制的宣称的去屑产品，需构建一套涵盖体外抑菌活性（MIC/MFC）、抗生物膜能力、抗代谢活性评估，以及核心的人体临床功效验证（结合头皮屑症状评分和马拉色菌定量检测）的多层次、综合性测试体系。其中，标准的随机双盲安慰剂对照人体试验是基石，而马拉色菌载量的定量检测（尤其是基于qPCR的方法） 结合头皮屑严重程度评分，为直接证明产品通过抑制目标菌群发挥去屑功效提供了强有力的科学证据链。整个测试过程必须秉持科学性、客观性、伦理性和严谨性，确保数据真实可靠，结论经得起推敲。