抗皱（DPPH）功效测试

发布时间：2025-06-16 16:22:51 阅读量：7 作者：生物检测中心

DPPH自由基清除测试在护肤品抗皱功效评价中的应用

一、引言：皱纹形成与自由基的密切联系

皮肤老化是一个复杂的生物学过程，其中氧化应激扮演着关键角色。环境因素（如紫外线辐射）和内部因素持续产生大量活性氧自由基（ROS）。这些高活性分子攻击皮肤细胞，破坏胶原蛋白和弹性蛋白结构，干扰细胞功能，最终导致皮肤松弛、失去弹性并形成皱纹。因此，中和自由基成为延缓皮肤老化和改善皱纹的关键策略，而评估物质的抗氧化能力则是预测其潜在抗皱功效的重要指标。

二、DPPH自由基清除测试：原理与操作

DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）测试是一种体外评价物质清除自由基能力的经典方法，因其操作简便、快速、稳定而得到广泛应用。

  • 核心原理：

    • DPPH分子在乙醇溶液中呈深紫色，在特定波长（通常为517nm）下有强烈吸收。
    • 当待测物质（具有抗氧化能力）加入DPPH溶液后，其有效成分能够捐献电子或氢原子给DPPH自由基。
    • 被中和的DPPH自由基转变为非自由基形式，溶液颜色从深紫色变为浅黄色。
    • 溶液颜色的变化程度（吸光度下降的程度）直接反映了待测物质的自由基清除能力。清除能力越强，颜色褪去越明显。

  • 标准化实验流程：

    1. 样品制备： 将待测护肤原料或配方（如植物提取物、合成抗氧化剂等）溶解或分散于合适溶剂（常用无水乙醇）中，配制成一系列不同浓度的溶液。
    2. DPPH溶液配制： 准确称取DPPH试剂溶解于无水乙醇中，配制特定浓度（通常约为0.1-0.2 mmol/L）的新鲜溶液，避光保存。
    3. 反应体系建立： 在避光条件下，将等体积的待测样品溶液与DPPH溶液充分混合。
    4. 避光孵育： 将混合溶液在室温下避光静置反应特定时间（通常为30分钟），以确保反应充分进行。
    5. 吸光度测定： 使用紫外-可见分光光度计，在517nm波长处测定反应后混合液的吸光度（Atest）。
    6. 对照组设置：
      • 空白对照： 用等体积溶剂代替样品溶液与DPPH溶液混合，测定吸光度（Acontrol）。
      • 本底对照： 用等体积溶剂代替DPPH溶液与样品溶液混合，测定吸光度（Ablank）。
    7. 清除率计算： 自由基清除率(%) = [1 - (Atest - Ablank) / Acontrol] × 100%

  • 关键评价指标：

    • 清除率: 直接反映在特定浓度下样品的即时清除能力。
    • IC50值： 表示清除50% DPPH自由基所需的样品浓度。IC50值越低，表明样品的自由基清除能力越强，是量化比较抗氧化活性的最常用指标。

三、DPPH测试与抗皱功效的关联性解读

通过DPPH测试证明物质具有显著的抗氧化能力，是预测其潜在抗皱功效的重要一步：

  1. 直接中和自由基： 有效清除过量的ROS，减少其对皮肤细胞（如成纤维细胞）的损伤，保护细胞活性与正常功能。
  2. 保护关键结构蛋白： 阻断自由基对真皮层胶原蛋白和弹性蛋白的氧化降解和交联损伤，有助于维持皮肤的支撑结构和弹性。
  3. 抑制炎症通路： ROS是引发皮肤炎症反应的重要因子。通过清除自由基，有助于减轻慢性低度炎症，而炎症是加速胶原降解和皮肤老化的一个关键因素。
  4. 支持细胞修复机制： 减少氧化损伤负担，使细胞能将更多资源投入到DNA修复、蛋白质合成等自我修复和更新过程中。
  5. 减缓光老化进程： 紫外线是皮肤外源性老化的主要元凶，其核心机制之一就是产生大量ROS。强效抗氧化剂是防御光老化的重要成分。

结论与意义

DPPH自由基清除测试作为一种稳健、标准化的体外方法，为评估护肤活性成分或配方的体外抗氧化能力提供了客观、可量化的数据（特别是IC50值）。强大的自由基清除能力是该物质具有潜在抗皱功效的必要生物学基础之一。

重要提示：

  1. 体外测试的局限性： DPPH结果是重要的筛选指标，但不能等同于最终的皮肤抗皱效果。护肤品的实际功效还受到透皮吸收能力、在皮肤环境中的稳定性、与其他成分的相互作用以及复杂的体内生物学过程等多种因素的影响。
  2. 综合评估的必要性： 完整的抗皱功效宣称需要建立在多维度证据链基础上。除DPPH等体外抗氧化测试外，通常还需要：
    • 细胞水平研究： 评估对成纤维细胞活力、胶原蛋白合成、基质金属蛋白酶（MMPs）抑制等的影响。
    • 人体功效评价： 通过专业的仪器测量（如皮肤弹性仪、皱纹图像分析）和受试者自我评估，在真实使用条件下验证产品改善皱纹的临床效果。
    • 安全性评估： 确保产品对皮肤温和无刺激。

总结：

DPPH自由基清除测试是评价护肤品抗皱潜力的重要起点和有力工具，揭示了物质对抗氧化应激这一关键老化机制的能力。其提供的定量数据（如IC50）便于筛选和比较候选活性物。然而，必须认识到其作为体外模型的局限性，最终的抗皱功效需通过更接近应用场景的体外细胞模型和严格的体内人体测试进行综合确认。将DPPH结果与其他生物学评价方法相结合，才能对护肤品的抗皱功效做出全面、科学的评估。