空间转录组学（10x Visium）

空间转录组学革命：深入解析10x Visium技术及其核心检测项目

引言

传统的转录组分析（如bulk RNA-seq或单细胞RNA-seq）虽然能提供基因表达的丰度信息，但都丢失了关键的空间背景信息。细胞在组织中的位置与其功能、状态以及与其他细胞的相互作用密切相关。空间转录组学应运而生，旨在将基因表达信息精确地锚定在组织结构的空间坐标上。在众多平台中，10x Genomics Visium 因其通量高、兼容性好、技术成熟度高等特点，已成为该领域最主流的解决方案之一。本文将深入探讨Visium技术原理，并重点解析其核心检测项目——它能为我们揭示哪些关键信息。

一、10x Visium技术原理简述

Visium技术的核心在于其特殊的空间基因表达载玻片（Slide）。每个Slide包含4个捕获区域（Capture Area）。每个捕获区域的表面覆盖着数百万个带有空间条形码（Spatial Barcode）和寡核苷酸捕获探针（Oligo Capture Probe）的微珠。这些微珠以规则的六边形网格排列（目前主要有两种规格：6.5x6.5mm区域包含约5000个捕获点，或11x11mm区域包含约10000个捕获点）。

工作流程关键步骤：

1. 组织制备：
   • 新鲜冷冻组织：切片（通常5-10 μm厚），固定在Visium Slide的捕获区域上。
   • FFPE组织：通过特定流程（如CytAssist仪器辅助）将组织切片转移到Slide上。这是Visium的重要优势，允许利用珍贵的存档样本。
2. 组织染色与成像： 对固定在Slide上的组织切片进行H&E染色或免疫荧光染色，并进行高分辨率光学成像。这一步获取组织形态学的空间信息。
3. 组织透化： 使用优化的透化试剂处理组织，使细胞膜通透化，释放细胞内的mRNA。
4. mRNA捕获与反转录： 释放的mRNA扩散到附近的微珠上，被寡核苷酸捕获探针捕获。捕获探针包含：
   • 空间条形码（Spatial Barcode）： 每个微珠位置有唯一的条形码组合，定义了该点在空间网格中的坐标（X, Y）。
   • UMI（Unique Molecular Identifier）： 用于标记每个被捕获的mRNA分子，校正PCR扩增偏差和测序错误，实现更准确的定量。
   • Poly(dT)序列： 特异性捕获带PolyA尾的mRNA。
   • 测序接头序列（Read 1, i7 Index, i5 Index）： 用于后续测序文库构建。
   • 捕获的mRNA在微珠表面进行原位反转录（RT），生成带有空间条形码和UMI信息的cDNA。
5. cDNA扩增与文库构建： 将带有空间信息的cDNA从Slide上洗脱下来，进行PCR扩增，构建成包含所有空间信息的测序文库。
6. 高通量测序： 在Illumina平台（如NovaSeq）上进行高通量测序。
7. 数据分析： 将测序数据比对到参考基因组，提取空间条形码（确定cDNA来源的空间位置）、UMI（用于分子计数）和基因信息（确定表达哪个基因）。最终将基因表达数据映射回最初获取的组织图像，实现空间分辨的基因表达谱。

二、核心检测项目：Visium能揭示什么？

Visium的核心检测能力在于生成一个空间分辨的全转录组表达矩阵。具体来说，它可以检测和分析以下关键项目：

1. 空间定位的基因表达：

   • 核心输出： 这是Visium最根本的检测项目。它提供整个组织切片上成千上万个位置点（Spot） 的基因表达谱。
   • 分辨率： 每个Spot（直径约55 μm）通常包含1-10个细胞（取决于组织类型和细胞密度），代表该局部区域的平均基因表达。注意：这不是单细胞分辨率，而是“近单细胞”或“多细胞”分辨率。
   • 数据形式： 一个庞大的基因（行）- Spot（列）表达矩阵，其中每个值代表该基因在该Spot的UMI计数（经过归一化处理）。每个Spot关联一个唯一的空间坐标（X, Y）。
   • 揭示内容： 哪些基因在组织的哪个特定区域（如肿瘤核心、侵袭边缘、正常基质、特定解剖结构）高表达或低表达。

2. 基因表达的空间变异与模式识别：

   • 检测项目： 识别基因表达在空间上的梯度变化、区域特异性富集（Domain/Cluster）、边界（Border）以及周期性模式等。
   • 分析方法： 通过空间聚类（如Seurat, BayesSpace）、空间差异表达分析、空间相关性分析等。
   • 揭示内容：
     • 鉴定组织中功能不同的空间区域（例如：免疫富集区、增殖区、坏死区、血管周区域）。
     • 发现驱动组织结构和功能空间异质性的关键基因和通路。
     • 识别肿瘤微环境中不同细胞组分（尽管是Spot水平平均）的空间分布关系（如癌细胞、免疫细胞、成纤维细胞）。

3. 细胞类型（或状态）的空间定位（去卷积）：

   • 检测项目： 利用已有的单细胞转录组数据（scRNA-seq）作为参考，推断每个Visium Spot内细胞类型的组成比例（解卷积）。
   • 分析方法： 空间解卷积算法（如SPOTlight, cell2location, RCTD, SpatialDWLS）。
   • 揭示内容：
     • 不同细胞类型（如T细胞亚群、巨噬细胞状态、特定的上皮细胞）在组织中的精确空间分布图谱。
     • 分析特定细胞类型之间的空间邻近性或排斥性（细胞互作线索）。
     • 可视化细胞类型丰度随空间位置的变化。

4. 空间差异表达基因分析：

   • 检测项目： 比较不同空间区域（如Cluster A vs Cluster B， 肿瘤区域 vs 正常区域， 边缘 vs 核心）之间的基因表达差异。
   • 分析方法： 类似单细胞分析中的差异表达，但考虑空间邻近性或区域分组（如使用SPARK, nnSVG, SpatialDE等考虑空间自相关性的方法）。
   • 揭示内容：
     • 鉴定特定解剖结构或病理区域（如生发中心、肿瘤侵袭前沿）的标志性基因。
     • 发现参与区域特异性功能或病理过程的基因和通路。
     • 为理解空间异质性的分子基础提供直接证据。

5. 空间共表达与基因调控网络：

   • 检测项目： 分析基因对在空间上的表达相关性（共定位），推断空间特异的基因调控模块或共表达网络。
   • 分析方法： 空间共表达分析（如SPARK-X）、基于图模型或NicheNet等推断调控关系。
   • 揭示内容：
     • 识别在特定空间环境中协同发挥功能的基因模块。
     • 推断空间特异的转录调控关系或细胞通讯信号。
     • 揭示组织区域功能背后的基因调控逻辑。

6. 空间轨迹与细胞分化/状态转变：

   • 检测项目： 在连续的组织结构（如发育中的器官、伤口愈合界面、肿瘤-基质界面）中，推断细胞状态或基因表达沿着空间路径的变化趋势（伪时间轨迹）。
   • 分析方法： 空间轨迹推断算法（如Slingshot, Monocle 3）。
   • 揭示内容：
     • 描绘发育、分化、激活或病理转变过程中基因表达动态的空间映射。
     • 识别驱动空间连续变化的关键调控因子。

7. 与组织学特征的整合分析：

   • 检测项目： 将基因表达的空间数据与H&E染色或免疫荧光（IF）图像提供的详细形态学信息（如特定细胞形态、组织结构、特定蛋白标记物的表达位置）进行关联和整合。
   • 分析方法： 图像分析分割特定区域/细胞，与转录组数据叠加；或利用深度学习模型（如图像-转录组联合嵌入）。
   • 揭示内容：
     • 将分子表型（基因表达）与经典的组织病理学表型精确关联。
     • 在特定形态结构背景下解释基因表达。
     • 验证空间转录组发现，并提供更丰富的生物学背景。

三、Visium的优势与局限

• 优势：
  • 全转录组覆盖： 检测几乎所有带PolyA尾的mRNA。
  • 高空间分辨率（组织层面）： Spot分辨率（55μm）对于许多组织结构和微环境研究足够。
  • 高通量： 单次实验可分析多个样本（一张Slide有4个捕获区域）。
  • 兼容性广： 支持新鲜冷冻和FFPE样本，极大扩展了样本来源。
  • 成熟的实验流程和分析生态： 标准化流程，配套分析软件（Space Ranger， Loupe Browser）及丰富的第三方分析工具。
  • 组织形态学整合： 与H&E/IF图像完美整合。
• 局限：
  • 非单细胞分辨率： 一个Spot包含多个细胞，是局部平均表达。需要结合解卷积或更高分辨率技术（如Visium HD或Xenium）获取更精细信息。
  • 灵敏度限制： 低丰度基因或表达量极低的细胞类型可能检测不到或信号较弱。
  • 组织厚度影响： 切片厚度可能导致不同层细胞的mRNA被同一个Spot捕获，增加复杂性。
  • 数据分析复杂性： 空间数据分析方法仍在快速发展中，需要一定的生物信息学基础。
  • 成本： 实验和测序成本相对较高。

四、应用场景

Visium技术已在多个生命科学和医学研究领域展现巨大价值：

• 发育生物学： 器官发生、模式形成、细胞命运决定的空间图谱。
• 神经科学： 脑区特异性表达、神经回路、疾病相关病理变化的空间定位。
• 肿瘤生物学/肿瘤微环境： 肿瘤异质性、侵袭前沿、免疫排斥/浸润、治疗耐药性机制的空间解析。
• 免疫学： 免疫细胞在淋巴组织或炎症/感染病灶中的空间组织、细胞互作。
• 疾病病理学： 神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病等的空间分子病理机制研究。
• 药物研发与生物标志物发现： 空间药效评估、发现具有空间特异性的治疗靶点和预后标志物。

五、总结

10x Visium空间转录组学技术通过将基因表达精确锚定在组织空间坐标上，为我们打开了理解组织复杂性、发育过程和疾病机制的全新维度。其核心检测项目——空间定位的基因表达谱——是构建所有高级分析（空间聚类、差异表达、去卷积、共表达、轨迹分析等）的基础。通过与组织学图像的整合，Visium数据能够将分子信息与形态学背景无缝连接，提供前所未有的生物学洞见。尽管存在分辨率限制等挑战，Visium凭借其成熟度、兼容性和强大的分析能力，已成为空间生物学研究中不可或缺的工具，持续推动着生命科学和精准医学的进步。随着技术的迭代（如更高分辨率的Visium HD）和算法的创新，空间转录组学将在未来揭示更多隐藏在组织空间结构中的生命奥秘。

重要提示：

• 本文重点在于解释Visium技术能检测和分析的核心内容（项目）。实际研究设计时，需要根据具体科学问题选择合适的样本类型、样本数量、重复设置、测序深度以及后续的分析策略。
• 实验流程和分析方法在不断更新优化，建议在进行实验前务必查阅10x Genomics官方最新的技术手册和应用指南，并关注领域内最新文献。