BD单细胞 WTA+Ab-seq

好的，BD单细胞平台（主要指BD Rhapsody™ 或 BD Symphony™ 系统）结合 WTA + Ab-seq 技术是一种强大的单细胞多组学解决方案。它允许在同一个单细胞中同时分析 全转录组 (Whole Transcriptome Analysis, WTA) 和 数十种表面蛋白 (Antibody-derived tag sequencing, Ab-seq) 的表达。

以下是一篇关于 BD WTA + Ab-seq 完整文章的框架，重点突出检测项目：

文章标题： 利用BD单细胞多组学平台（WTA + Ab-seq）解析复杂组织中的细胞异质性：转录组与表面蛋白的同步分析

摘要

单细胞多组学技术极大地推动了我们对细胞类型、状态和功能的深入理解。BD单细胞平台结合WTA（全转录组分析）和Ab-seq（抗体标签测序）技术，实现了在单细胞分辨率下对基因表达和表面蛋白丰度的同步、高效、精准检测。本文详细阐述了BD WTA + Ab-seq技术的原理、实验流程、核心检测项目及其在生物医学研究中的广泛应用价值，重点介绍了该技术所能检测的关键生物学信息。

引言

• 细胞异质性的重要性及其在发育、免疫、肿瘤等领域的核心作用。
• 单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 的局限：仅提供转录组信息，难以精确捕捉某些关键蛋白（尤其是低丰度转录本或受翻译后调控的蛋白）的表达。
• 流式或质谱流式细胞术的局限：通量有限，无法同时获取深度转录组信息。
• BD WTA + Ab-seq的优势： 在单细胞水平无缝整合转录组（~20,000+基因）和数十种关键表面蛋白（~20-100+种）的信息，提供更全面的细胞图谱。

技术原理与流程概述

1. 样本制备： 组织解离成单细胞悬液，保证细胞活性。
2. Ab-seq抗体标记： 使用带有独特分子标识符 (UMI) 和 PCR handle 的寡核苷酸标记抗体孵育细胞，特异性结合目标表面抗原。(核心：抗体-寡核苷酸偶联物是关键试剂)
3. BD单细胞捕获与标签： 细胞被装载到BD Rhapsody/Symphony微孔板或纳升液滴中，每个细胞与一个携带细胞条形码 (Cell Barcode) 和 UMI 的磁珠结合。
4. 裂解与分子捕获： 细胞裂解，mRNA 通过poly-dT引物结合到磁珠上；同时，结合在细胞表面的Ab-seq抗体寡核苷酸标签也被捕获到同一个磁珠上。
5. 逆转录与文库构建：
   • WTA文库： mRNA逆转录成cDNA，进行全转录组扩增，构建测序文库。
   • Ab-seq文库： Ab-seq抗体标签（包含抗体条形码和UMI）通过特异性引物进行PCR扩增，构建独立的测序文库。
6. 高通量测序： WTA文库和Ab-seq文库分别进行Illumina高通量测序。

核心检测项目 (重点)

BD WTA + Ab-seq 技术能够从同一个单细胞中检测和分析以下关键信息：

I. 转录组层面 (WTA)

1. 基因表达定量：
   • 检测单细胞中 >20,000个人类/小鼠基因 的表达水平（转录本丰度）。
   • 基于UMI进行绝对分子计数，实现高精度、低偏差的定量，有效去除PCR扩增偏好性和测序错误影响。
2. 细胞身份鉴定与聚类：
   • 基于基因表达谱，使用无监督聚类算法（如Seurat, Scanpy）将细胞划分为不同的亚群 (Clusters)。
   • 通过已知的Marker基因表达，对细胞亚群进行注释 (Cell Type Annotation)，识别主要的细胞类型（如T细胞、B细胞、髓系细胞、基质细胞、肿瘤细胞等）。
3. 差异表达基因分析：
   • 比较不同细胞亚群之间、不同处理条件（如疾病vs健康，处理vs对照）下细胞之间的差异表达基因 (Differentially Expressed Genes, DEGs)。
   • 揭示驱动细胞状态转变或功能差异的关键调控基因和通路。
4. 细胞状态与功能分析：
   • 评估细胞的活化状态 (如T细胞耗竭、激活标记物)。
   • 推断细胞周期阶段 (G1/S/G2M)。
   • 计算通路活性/功能评分 (如代谢、信号通路、特定生物学功能模块)。
   • 分析转录因子调控网络。
5. 谱系追踪与发育轨迹： 利用伪时序分析 (如Monocle, Slingshot) 推断细胞分化或状态转变的动态轨迹 (Trajectory)。

II. 表面蛋白层面 (Ab-seq)

1. 表面蛋白丰度定量：
   • 检测单细胞中数十种 (通常20-100+种) 预选关键表面蛋白的表达水平。
   • 同样基于UMI进行绝对计数，提供蛋白表达的数字化定量结果。
2. 蛋白Marker共表达分析：
   • 分析不同表面蛋白在单细胞上的共表达模式 (Co-expression Patterns)。
   • 精确识别表达特定蛋白组合的细胞亚群（如CD4+ CD25+ FOXP3+ Treg细胞）。
3. 高精度细胞分型与验证：
   • 利用表面蛋白信息验证和精细化基于转录组定义的细胞类型。例如：
     • 区分CD8+ Naïve, Effector, Memory T细胞亚型。
     • 精确鉴定不同单核/巨噬细胞亚群 (通过CD14, CD16, HLA-DR等)。
     • 识别特定的免疫检查点蛋白表达 (如PD-1, CTLA-4, TIM-3)。
     • 区分恶性细胞 (通过肿瘤相关抗原)。
   • 表面蛋白作为直接、稳定、高度特异性的Marker，可解决仅靠转录组难以区分或Marker基因表达模糊的问题。
4. 稀有细胞群体识别： 结合高特异性蛋白Marker，提高稀有细胞类型（如循环肿瘤细胞、特定干细胞、罕见免疫亚群）的检出率和鉴定可信度。

III. 多组学整合分析 (WTA + Ab-seq)

这是BD WTA + Ab-seq技术的核心价值所在：

1. 关联分析：
   • 在单细胞水平直接关联基因表达与特定表面蛋白的表达。
   • 探究转录调控与蛋白表达之间的一致性或异质性 (例如，某个基因mRNA高但对应蛋白低，可能指示翻译后调控)。
2. 多模态聚类与注释：
   • 结合基因表达和蛋白表达数据，使用多组学整合算法 (如TotalVI, CiteFuse) 进行联合聚类 (Joint Clustering)。
   • 获得更准确、更精细、生物学意义更明确的细胞分型结果。例如，在肿瘤微环境中，可以更清晰地区分恶性细胞、不同免疫浸润细胞亚群及其功能状态。
3. 细胞状态深度解析：
   • 整合信息揭示细胞更全面的功能状态。例如，T细胞不仅通过转录组判断耗竭，还能通过PD-1, LAG3等蛋白确认其耗竭表型。
4. 发现新型生物标志物：
   • 通过关联分析，发现与特定蛋白表达模式或细胞状态密切相关的新型转录组标志物，或反之发现新的蛋白标志物组合。
5. 构建更完整的细胞图谱： 为复杂组织或疾病样本提供包含基因和蛋白双重信息的高分辨率细胞图谱 (Cell Atlas)。

应用场景

• 肿瘤免疫微环境 (TIME) 研究： 解析肿瘤内免疫细胞组成、状态（活化/耗竭）、免疫检查点表达、肿瘤细胞异质性及相互作用。
• 免疫治疗研究： 评估治疗前后免疫细胞组成和功能状态变化，寻找疗效预测和耐药生物标志物。
• 免疫系统发育与分化： 追踪免疫细胞谱系分化轨迹，研究不同发育阶段细胞的特异性标记。
• 自身免疫病与炎症： 鉴定致病性免疫细胞亚群及其激活状态。
• 神经科学： 精细分型神经元、胶质细胞亚群，研究细胞表面受体表达。
• 干细胞与发育生物学： 识别多能干细胞、祖细胞及其分化过程中的分子变化。

技术优势总结

• 真正的单细胞多组学： 同一细胞，同时检测RNA和蛋白。
• 高灵敏度与特异性： UMI技术确保定量准确，抗体经严格验证保证特异性。
• 高通量： 可分析数千至上万个单细胞。
• 灵活性： Ab-seq抗体组合可根据研究目标灵活定制。
• 数据整合强大： 提供专门的生信流程进行多组学数据整合分析。

讨论

• 强调Ab-seq抗体选择的重要性（特异性、验证、滴定）。
• 讨论Ab-seq检测的蛋白范围限制（目前主要是表面蛋白）。
• 展望未来与其他组学（如ATAC-seq）整合的可能性。
• 总结该技术在推动精准医学和靶向治疗发现中的巨大潜力。

参考文献

• Stoeckius, M., et al. (2017). Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods, 14(9), 865–868. (里程碑式论文，奠定了CITE-seq/Ab-seq基础)
• BD Biosciences官方技术手册与应用指南。
• 相关领域内利用BD WTA + Ab-seq技术发表的高影响力研究论文。

致谢

(略)

重点强调：

• 核心检测价值在于“同一细胞，双重信息” (RNA + Protein)。
• Ab-seq不是取代转录组，而是对其进行强有力的补充和验证。
• 多组学整合分析是挖掘生物学洞见的关键，能揭示仅靠单一组学无法发现的细胞异质性和功能状态。

这篇框架文章将BD WTA + Ab-seq技术的核心检测项目（转录组、表面蛋白、多组学整合）作为重中之重进行了详细阐述，突出了其作为单细胞多组学工具的强大能力。实际撰写时，可以根据具体的研究实例和数据进一步丰富和深化。