单细胞核转录组测序

单细胞核转录组测序 (snRNA-seq)：解锁冷冻组织中的细胞图谱，重点解析检测项目

单细胞转录组测序 (scRNA-seq) 彻底改变了我们理解复杂组织中细胞异质性的能力。然而，其一个主要限制是：它需要新鲜、高质量、可解离成完整活细胞的样本。这对于许多难以解离的组织（如脑、脂肪、心脏）或珍贵的存档临床样本（如生物库中的冷冻组织）来说，是一个巨大的障碍。单细胞核转录组测序 (snRNA-seq) 应运而生，成为解决这一难题的关键技术，它绕过了对完整活细胞的需求，直接从细胞核中捕获转录组信息。

一、 snRNA-seq 技术核心原理

• 样本起点： 不是完整的细胞，而是细胞核。
• 样本来源： 冷冻组织 (如手术切除后液氮速冻保存的组织、生物库样本) 或 难以解离的新鲜组织。
• 核心步骤：
  1. 核分离： 将冷冻或新鲜组织在特殊缓冲液中机械或化学裂解，释放出细胞核。
  2. 核悬液制备与质检： 纯化细胞核，去除细胞碎片，评估核的完整性和浓度。
  3. 文库构建： 利用与 scRNA-seq 相似的高通量平台（如 10x Genomics, Drop-seq, sci-RNA-seq），但专门针对细胞核进行优化：
     • 单个核被包裹在油滴或微孔中。
     • 在油滴/微孔内，每个核的RNA被逆转录成 cDNA，并加上 细胞核特异性的条形码 (Nuclear Barcode, 或称 Cell Barcode) 和 唯一的分子标识符 (UMI)。
     • 所有带有相同核条形码的 cDNA 片段被认为来源于同一个细胞核。
  4. 高通量测序： 对构建好的文库进行大规模平行测序（通常是 Illumina 平台）。
  5. 生物信息学分析： 对测序数据进行处理和分析（比对、定量、细胞核鉴定、基因表达矩阵生成等）。

二、 snRNA-seq 的核心优势：为什么选择它？

• 核心价值：解锁冷冻组织！ 这是 snRNA-seq 最大的优势。它使得利用大量存档的、珍贵的临床样本（如肿瘤库、脑库、队列研究的冻存样本）进行单细胞分辨率研究成为可能，极大地拓展了研究材料来源。
• 攻克“顽固”组织： 对于像大脑（神经元轴突长、脆弱）、骨骼肌、脂肪组织、纤维化组织等难以用酶解方法分离出高质量单细胞悬液的组织，snRNA-seq 提供了可行的替代方案。
• 降低解离偏倚： 组织解离过程本身可能对某些脆弱细胞类型造成选择性损失或激活应激反应，影响转录组状态。核分离过程相对温和，可能更好地保留原始状态。
• 样本稳定性： 分离出的细胞核可以在特定缓冲液中冷冻保存较长时间，方便实验安排和异地运输。
• 与空间组学兼容： 核悬液可以作为某些空间转录组技术（如 Visium）的输入，实现空间信息与单核分辨率的结合。

三、 snRNA-seq 的核心检测项目（重点）

snRNA-seq 的终极目标是解析组织在单细胞（核）分辨率下的转录组图谱。其核心检测项目围绕着对测序数据进行分析挖掘，以回答关键的生物学问题：

1. 细胞类型鉴定与注释：

   • 检测内容： 基于每个核的基因表达谱，利用已知的标记基因或通过无监督聚类算法（如 Louvain, Leiden），将成千上万个核划分成不同的群体。
   • 目的： 识别组织中存在的主要细胞类型（如神经元、胶质细胞、免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞等）及其相对比例。这是构建细胞图谱的基础。
   • 关键输出： 细胞类型分类图 (t-SNE/UMAP 可视化)，细胞类型特异性标记基因列表。

2. 细胞亚型/状态解析：

   • 检测内容： 在主要细胞类型内部进行更精细的聚类分析，识别具有更特异转录特征的亚群（例如，兴奋性神经元中的不同层别亚型，小胶质细胞的不同激活状态，T细胞的不同亚群）。
   • 目的： 揭示细胞类型内部的功能异质性和分化/激活轨迹。
   • 关键输出： 亚型分类图，亚型特异性标记基因，亚型功能富集分析。

3. 基因表达定量与分析：

   • 检测内容： 计算每个基因在每个细胞核中的表达量（通常用 UMI 计数标准化后的值表示，如 CPM, TPM）。
   • 目的：
     • 差异表达分析： 比较不同组间（如疾病 vs 对照，处理 vs 未处理）或不同细胞类型/亚型间特定基因的表达水平差异。这是发现疾病相关基因、治疗靶点或功能标志物的核心方法。
     • 基因表达可视化： 在聚类图上展示特定基因的表达分布 (Feature Plots, Violin Plots, Dot Plots)。
     • 细胞类型丰度变化： 通过比较不同样本间各细胞类型/亚型的比例差异，推断疾病或干预对特定细胞群体的影响。

4. 通路与功能富集分析：

   • 检测内容： 对差异表达基因集进行基因本体论 (GO)、京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 或其他通路数据库的富集分析。
   • 目的： 揭示在特定细胞类型、状态或处理条件下，哪些生物学过程、信号通路或分子功能被显著激活或抑制，从而理解细胞活动的生物学意义。
   • 关键输出： 富集通路列表及显著性 (p-value, FDR)。

5. 细胞通讯分析：

   • 检测内容： 基于配体-受体对数据库，预测不同细胞类型/亚型之间潜在的信号交流。
   • 目的： 推断组织中细胞群体间相互作用的网络，理解微环境调控机制（尤其在肿瘤免疫、神经免疫等领域非常重要）。
   • 关键输出： 配体-受体相互作用网络图，相互作用的强度评分。

6. 轨迹推断与伪时序分析：

   • 检测内容： 利用算法（如 Monocle3, Slingshot, PAGA）将细胞核根据基因表达的连续性变化排列在假定的分化、发育或激活轨迹上。
   • 目的： 重建细胞的动态变化过程（如干细胞分化、免疫细胞激活、细胞状态转变），识别驱动这些过程的关键基因。
   • 关键输出： 伪时序轨迹图，轨迹分支点，沿轨迹变化的基因列表。

7. 整合分析：

   • 检测内容： 将 snRNA-seq 数据与其他组学数据（如 bulk RNA-seq, scATAC-seq（单细胞核染色质可及性测序）, 空间转录组，蛋白质组）进行联合分析。
   • 目的： 提供更多维、更全面的生物学视角。例如：
     • snRNA-seq + scATAC-seq: 在单核水平关联基因表达与染色质开放区域，揭示基因调控机制。
     • snRNA-seq + 空间转录组： 将细胞类型/状态信息映射回组织原位，理解空间组织模式。
     • snRNA-seq + bulk RNA-seq: 对大量样本进行细胞类型组成解卷积 (deconvolution)。

四、 snRNA-seq 的关键特点与注意事项

• 优势：
  • 样本适用性广： 最大优势，解锁冷冻和难解离组织。
  • 降低解离偏倚： 可能更接近体内原始状态。
  • 稳定性： 核悬液相对稳定。
• 局限性：
  • 核RNA信息量： 细胞核RNA主要包含未剪接的前体mRNA、部分成熟mRNA和非多聚腺苷酸化RNA。相对于完整细胞的胞质RNA，缺乏大部分成熟的胞质mRNA。这可能导致：
    • 检测到的基因总数和表达量通常低于 scRNA-seq。
    • 对某些低丰度转录本或特定类型RNA（如部分lncRNA）的检测灵敏度降低。
    • 内含子信号占比高： 分析时需考虑这一点。
  • 细胞形态信息缺失： 仅分析核，丢失了细胞大小、形态等物理信息。
  • 应激反应影响： 虽然解离偏倚降低，但冷冻/解冻/核分离过程本身也可能引入一定的应激反应。
  • 核完整性要求： 核分离质量对数据质量影响大，破碎的核会产生噪音。

五、 核心应用领域

snRNA-seq 因其对样本的宽容性，在以下领域大放异彩：

1. 神经科学： 研究人脑和其他神经组织的细胞组成、神经元亚型多样性、神经胶质细胞状态（尤其在阿尔茨海默病、帕金森病等研究中）。
2. 肿瘤生物学： 分析存档的肿瘤样本（原发灶、转移灶），研究肿瘤微环境中的细胞异质性、免疫浸润状态、癌细胞亚群及其演变。
3. 发育生物学： 利用冻存的胚胎或组织样本，研究发育过程中的细胞命运决定和谱系关系。
4. 心血管疾病： 研究心脏、血管等难以解离组织中的细胞组成变化。
5. 生物库研究： 对大型队列研究的珍贵冻存样本进行回顾性单细胞水平分析，寻找疾病标志物和分型依据。
6. 免疫学： 分析淋巴器官或炎症组织中免疫细胞的组成、状态和相互作用。

六、 总结

单细胞核转录组测序 (snRNA-seq) 是一项革命性的技术，它通过直接捕获细胞核内的转录组信息，成功突破了传统单细胞测序对新鲜活细胞样本的严苛限制。其核心价值在于能够广泛应用于冷冻保存的临床样本和难以解离的复杂组织，极大地拓展了单细胞研究的边界。其核心检测项目围绕着构建单核水平的转录组图谱展开，包括细胞类型/亚型鉴定、基因表达定量与差异分析、功能通路富集、细胞通讯预测、轨迹推断以及与其他组学数据的整合分析。虽然它在基因检测深度上略逊于基于完整细胞的 scRNA-seq，但其无可比拟的样本适用性使其成为研究人类疾病（尤其是神经系统疾病、癌症）、发育过程以及利用生物库资源的关键工具。随着技术的不断优化和分析方法的进步，snRNA-seq 将继续深化我们对复杂生物系统在健康和疾病状态下的细胞基础的理解。

核心检测项目一览表