单细胞免疫组测序（10x 5'）

单细胞免疫组测序（10x Genomics 5'）：解锁免疫组库的细胞分辨率

单细胞免疫组测序（scVDJ-Seq），特别是基于10x Genomics 5' 端试剂盒的技术，已成为免疫学研究的革命性工具。它突破了传统批量测序的局限，在单细胞分辨率上同时解析免疫受体（TCR/BCR）的完整序列和全转录组信息，为深入理解适应性免疫应答的细胞基础提供了前所未有的视角。

核心原理与技术优势（5' vs 3'）

• 技术核心： 利用微流控技术将单个细胞与带有独特分子标识符（UMI） 和 细胞条形码（Cell Barcode） 的凝胶微珠包裹在油滴内。在微滴内进行逆转录，生成携带相同细胞条形码和UMI的cDNA文库。
• 5' 试剂盒的关键优势（针对免疫组库）：
  • 全长V(D)J捕获： 特别优化用于捕获T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）的α链、β链（TCR）或重链（BCR）、轻链（κ和λ） 的全长可变区（包含V、D、J基因和关键的CDR3区域）。这是解析完整抗原结合特异性的基础。
  • 基因表达与免疫组库的完美耦合： 同一个细胞的mRNA被捕获并标记上相同的细胞条形码。这意味着：
    • 免疫受体序列（TCR/BCR）和该细胞的基因表达谱（转录组）天然关联。
    • 可以明确知道哪个T/B细胞表达了哪个特定的TCR/BCR序列。
    • 可以将免疫细胞的克隆状态（由TCR/BCR序列定义）与其功能状态（由基因表达定义，如激活、耗竭、记忆、效应等）直接关联起来。
  • 更高的免疫组库捕获效率： 相比10x的3'转录组试剂盒（虽然也能做VDJ，但非最优），5'试剂盒在引物设计和流程上针对免疫球蛋白和TCR基因的可变区进行了优化，显著提高了成功捕获并测序到功能性TCR/BCR序列的细胞比例。

核心检测项目：解锁免疫组库的细胞奥秘

10x 5' 单细胞免疫组测序的核心价值在于提供以下单细胞水平的关键信息：

1. T细胞受体（TCR）分析：

   • TRA 和 TRB 链全长序列： 检测每个T细胞表达的TCR α链和β链的完整可变区核苷酸和氨基酸序列。
   • CDR3序列： 精确识别决定TCR抗原结合特异性的核心区域 - 互补决定区3（CDR3） 的核苷酸和氨基酸序列。这是识别特异性克隆的“指纹”。
   • V(D)J基因使用： 确定构成每条TCR链的 V（可变）基因、D（多样性）基因（仅β链）、J（连接）基因的具体片段。分析V/J基因的偏好性。
   • 克隆型（Clonotype）定义与频率： 基于独特的TRA+TRB CDR3氨基酸序列对（或TRB CDR3序列，当α链未成功捕获时）定义T细胞克隆型。计算每个克隆型在样本中的细胞数量（克隆大小/频率），识别扩增的优势克隆。
   • 克隆多样性： 通过多种指标（如香农多样性指数、辛普森指数、克隆型数量等）量化样本中T细胞克隆组成的多样性。
   • 克隆扩增与富集分析： 比较不同样本（如肿瘤vs 外周血，治疗前vs 治疗后）或不同细胞亚群（如CD8+ vs CD4+）中特定克隆型的扩增或富集情况，寻找抗原驱动的应答。

2. B细胞受体（BCR）分析：

   • IGH、IGK、IGL 链全长序列： 检测每个B细胞表达的BCR重链（IGH）和轻链（IGK或IGL）的完整可变区核苷酸和氨基酸序列。
   • CDR3序列： 精确识别重链和轻链的CDR3核苷酸和氨基酸序列。
   • V(D)J基因使用： 确定构成每条BCR链的 V、D（仅重链）、J 基因的具体片段。分析V/J基因的偏好性。
   • 等型/亚型（Isotype）分析： 通过重链恒定区（C区）序列确定抗体的类别（如IgM, IgD, IgG1-4, IgA1-2, IgE）和亚型。这对于理解体液免疫应答的阶段和功能至关重要。
   • 体细胞高频突变（SHM）分析： 计算重链和轻链可变区相对于胚系基因序列的突变频率和模式，评估B细胞经历的亲和力成熟程度。
   • 克隆型（Clonotype）定义与频率： 基于独特的IGH CDR3氨基酸序列（或更严格的IGH+轻链CDR3组合）定义B细胞克隆型。计算克隆频率和多样性。
   • 克隆谱系（Lineage）与进化树： 对来自同一祖细胞的B细胞克隆（共享相同V(D)J重组和IGH CDR3），通过其SHM模式的差异构建系统发育树，可视化克隆内部的进化关系，追踪亲和力成熟过程。
   • 配对轻重链信息： 在单细胞分辨率上，天然配对地获得每个B细胞表达的重链和轻链序列。这是解析真正功能性抗体特异性的关键，避免了批量测序或杂交瘤技术中的链错配问题。对于抗体发现和疫苗研究意义重大。

3. 免疫组库多样性深度解析：

   • 综合评估样本整体或特定亚群的TCR/BCR库的丰富度（克隆型数量）、均匀度（克隆大小分布）和多样性指数。
   • 比较不同条件下（疾病状态、治疗干预、时间点等）免疫组库多样性的动态变化。

4. 整合分析：免疫组库 + 单细胞转录组 (GEX - Gene Expression)

   • 这是10x 5'技术的最大亮点和核心价值。通过共享的细胞条形码，将每个细胞的免疫受体序列（VDJ）与其完整的mRNA表达谱（GEX）无缝关联。
   • 功能状态关联： 将特定的T/B细胞克隆型（由VDJ序列定义）与该克隆内细胞的基因表达特征关联起来。例如：
     • 识别肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中具有特定克隆型的T细胞是否表现出耗竭（高表达PD-1, CTLA-4, TIM-3等）、细胞毒（高表达GZMB, PRF1）或组织驻留（高表达CD103, CD69）的特征。
     • 分析抗原特异性B细胞克隆（如针对特定病毒）是否处于浆母细胞/浆细胞状态（高表达CD38, SDC1, XBP1）或记忆B细胞状态。
   • 细胞亚群注释： 利用GEX数据对细胞进行聚类和注释（T细胞亚群：CD4+ Naive, Treg, Th1, Th17, CD8+ Naive, Effector, Memory 等；B细胞亚群：Naive, Memory, Plasma等），然后在亚群水平分析免疫组库特征（如记忆B细胞中的SHM水平，效应CD8 T细胞中的克隆扩增）。
   • 抗原特异性预测 (间接)： 结合克隆扩增、T细胞激活/效应状态（GEX）以及已知的抗原特异性TCR数据库（如VDJdb, McPAS-TCR），可对某些克隆型潜在的抗原特异性进行推测。

5. 双细胞检测： 识别并过滤掉在微流控分选中意外包裹在同一个油滴内的两个细胞（双细胞），确保单细胞数据的准确性。

关键应用场景

• 肿瘤免疫学：
  • 鉴定肿瘤微环境中浸润的T/B细胞克隆组成、扩增状态和功能状态。
  • 追踪治疗（如免疫检查点抑制剂、过继细胞治疗CAR-T/TCR-T）前后抗原特异性T细胞克隆的动态变化和功能演变。
  • 研究免疫编辑和免疫逃逸机制。
  • 发现新的肿瘤特异性TCR/BCR（用于细胞治疗或抗体药物开发）。
• 自身免疫病与炎症性疾病： 识别驱动疾病的自身反应性T/B细胞克隆，分析其激活状态、组织分布和克隆特性。
• 感染免疫学： 追踪病原体特异性T/B细胞应答的动态变化（克隆扩增、记忆形成、耗竭），评估疫苗效果，发现广谱中和抗体。
• 基础免疫学： 研究T/B细胞在生理条件下的发育、选择、耐受建立、记忆形成等过程的分子机制和克隆动力学。
• 移植免疫： 监测移植后排斥反应相关的同种异体反应性T细胞克隆。
• 抗体发现： 直接从人体（感染康复者、疫苗接种者、自身免疫病患者）中高效发现具有治疗潜力的天然配对抗体序列。

样本要求与实验考虑

• 样本类型： 新鲜分离的活细胞悬液是首选（外周血单个核细胞PBMCs，淋巴结、脾脏、肿瘤组织解离细胞，灌洗液细胞等）。冻存复苏的细胞也可使用，但活率和数据质量可能受影响。
• 细胞活性： >80% (推荐 >90%) 的高细胞活性至关重要，死细胞会导致数据噪音和微珠浪费。
• 细胞浓度与数量： 需要精确控制细胞浓度以达到最佳包裹效率。目标细胞数需根据实验设计确定（通常数千至数万）。
• 对照： 强烈建议使用细胞系混合样本（如10x提供的Cell Ranger兼容细胞系）作为阳性对照评估实验流程效率。

数据分析核心流程

1. Cell Ranger (10x Genomics官方套件)：
   • cellranger mkfastq: 原始测序数据（BCL）转换为FASTQ。
   • cellranger count (GEX): 处理基因表达数据（比对、UMI计数、细胞识别）。
   • cellranger vdj (VDJ): 专门处理TCR/BCR数据（组装、注释、克隆型分型）。
   • cellranger multi (推荐): 整合处理同一样本的GEX和VDJ数据。
2. Loupe VDJ Browser / Loupe Browser： 10x提供的交互式可视化软件，用于直观探索VDJ和整合的GEX+VDJ数据。
3. 高级分析 (R/Python生态系统)：
   • 免疫组库分析： scRepertoire, Immunarch, VDJtools 用于深入分析克隆型、多样性、V(D)J使用、SHM等。
   • 单细胞转录组分析： Seurat, Scanpy 用于细胞聚类、注释、差异表达分析。
   • 整合分析： 在Seurat/Scanpy对象中无缝整合VDJ信息，进行关联分析。

重要注意事项

• 并非100%捕获： 并非所有T/B细胞都能成功捕获到配对的、功能性的、完整的TCR/BCR序列。捕获效率受多种因素影响（细胞状态、RNA质量、实验操作等）。数据分析时需考虑这一局限性。
• 深度要求： 获得高质量、完整的TCR/BCR序列需要足够的测序深度，特别是对于高变异的CDR3区域。
• 数据分析复杂性： 整合分析GEX和VDJ数据需要较强的生物信息学能力。正确解读克隆型与表型的关联需要严谨的统计学和生物学背景知识。
• 成本： 单细胞测序成本相对较高，需合理规划实验。

总结

10x Genomics 5' 单细胞免疫组测序技术通过将免疫受体（TCR/BCR）的全长序列分析与全转录组分析在单细胞分辨率上进行天然耦合，彻底改变了我们对适应性免疫的理解方式。其核心检测项目——精确解析T/B细胞的克隆型、CDR3序列、V(D)J基因使用、克隆频率、多样性、体细胞高频突变（BCR）、抗体同型，特别是将这些信息与细胞的分子表型和功能状态直接关联——为研究免疫应答的细胞基础、疾病机制（肿瘤、自身免疫、感染）、治疗监测（免疫治疗、移植）以及治疗性抗体/TCR发现提供了前所未有的强大工具。尽管存在技术挑战和成本考虑，其产生的海量、高维、整合的数据正在持续推动免疫学研究和精准医疗的边界。