以下是一篇关于单细胞转录组测序（10x Genomics 3’ 平台）的完整技术文章，重点阐述检测项目流程、核心技术与关键分析内容，适用于科研方案设计或实验报告参考：

单细胞转录组测序（10x Genomics 3’ 平台）完整检测项目指南

一、技术概述

单细胞转录组测序（scRNA-seq）通过在单个细胞水平解析基因表达谱，揭示细胞异质性、鉴定罕见细胞类型、追踪发育轨迹及解析微环境互作。10x Genomics Chromium 3’ 平台凭借其高通量、高捕获效率及标准化流程，成为当前主流的商业化解决方案。其核心基于微流控油滴包裹技术（GEM, Gel Bead-in-Emulsion），实现单细胞分离、mRNA捕获与条形码标记的一体化。

二、核心检测项目流程

1. 样本制备与质检

样本类型：新鲜组织（优先）、冻存组织（需验证复苏方案）、悬浮细胞（如血液、培养细胞）。
关键步骤：
- 组织解离：使用优化酶解方案（如胶原酶/DNase）获得高活性单细胞悬液。
- 细胞过滤：40μm滤网去除细胞团块。
- 细胞计数与活性检测：台盼蓝或AO/PI染色，要求活细胞率 > 85%，浓度调整至700–1,200个细胞/μL。
- 去除死细胞（可选）：Dead Cell Removal Kit 或 FACS 分选提升数据质量。

2. 单细胞捕获与文库构建（10x Chromium系统）

GEM生成：细胞、凝胶微珠（含寡核苷酸条形码）、酶混合液在微流控芯片中被油相包裹形成油滴（GEM）。
关键反应：
- 细胞裂解，mRNA释放。
- Oligo-dT捕获mRNA的polyA尾。
- 模板转换（RT）：合成带细胞条形码（Cell Barcode）、UMI（Unique Molecular Identifier）及测序接头的cDNA。
产物：含全长cDNA的GEMs。

3. cDNA扩增与文库制备

cDNA扩增：PCR扩增GEM中的cDNA。
片段化与末端修复：制备Illumina兼容文库。
接头连接与样本索引添加：引入P5/P7测序接头及Sample Index（多重样本混合测序）。
文库质检：Agilent Bioanalyzer/Fragment Analyzer检测片段大小（主峰~550bp），Qubit定量。

4. 高通量测序（Illumina平台）

测序策略：
- Read 1：26-28 bp（包含Cell Barcode + UMI）。
- i7 Index：8 bp（Sample Index）。
- Read 2：≥90 bp（基因序列）。
推荐深度：50,000–100,000 reads/细胞（常规研究），稀有细胞或复杂样本需更高深度（>100,000 reads/细胞）。
测序平台：NovaSeq 6000（主流）、HiSeq X Ten。

三、核心检测内容与生信分析

1. 原始数据处理与质控（Cell Ranger流程）

数据拆分：根据Sample Index分离混合样本。
序列比对：参考基因组（如GRCh38）比对，基因定量。
关键输出：
- 基因-细胞表达矩阵：行=基因，列=细胞，值=UMI计数。
- 质控指标：
  - 每个细胞的UMI数：反映测序深度。
  - 每个细胞的基因数：衡量转录组覆盖度。
  - 线粒体基因占比：>15%提示细胞损伤（需过滤）。
  - 核糖体基因占比：异常高可能为低质量细胞。