体外溶血试验

体外溶血试验：原理、方法与应用

体外溶血试验是一种重要的药物安全性评价方法，用于评估药物、医疗器械浸提液、生物材料或化学物质引发红细胞破裂（溶血）的能力。溶血不仅可能导致贫血、黄疸等不良反应，也是物质潜在细胞毒性和生物相容性的重要指标。该试验在药物筛选、医疗器械评估等领域广泛应用。

一、 试验原理

红细胞膜具有半透性，维持着细胞内外渗透压平衡及正常形态（双凹圆盘状）。当受试物作用于红细胞时，可通过以下机制导致膜破裂，血红蛋白释放：

1. 渗透压失衡： 受试物浓度过高（高渗）或过低（低渗）导致水分子异常进出，细胞肿胀或皱缩破裂。
2. 膜蛋白损伤： 受试物直接溶解或氧化膜脂质、蛋白质，破坏膜结构完整性。
3. 氧化应激： 自由基等活性物质攻击膜脂质，引发脂质过氧化链式反应。
4. 表面活性剂作用： 某些物质（如清洁剂）破坏膜脂质双分子层稳定性。
5. 补体激活： （某些特定试验设计）受试物激活血浆补体系统，形成膜攻击复合物。

溶血程度通过测定释放到上清液中的血红蛋白浓度来量化。

二、 试验材料与方法

1. 主要材料：

   • 红细胞来源： 通常使用健康人或动物（如兔、大鼠）的新鲜抗凝全血。人血（通常来自志愿者并经伦理批准）是金标准，尤其用于最终产品评价。常用抗凝剂为EDTA-K2或肝素钠。
   • 阴性对照： 生理盐水（0.9% NaCl），应不引起显著溶血（接近0%）。
   • 阳性对照： 已知能引起100%溶血的物质，常用蒸馏水（低渗）或特定浓度的表面活性剂（如Triton X-100）。
   • 受试物溶液： 将待测样品（原料药、制剂、浸提液等）用生理盐水或其他适当溶剂溶解/稀释至一系列测试浓度。溶剂本身需进行溶血评价（溶剂对照）。
   • 缓冲液： 如磷酸盐缓冲液（PBS），用于洗涤红细胞和稀释。

2. 试验程序（以静态孵育法为例）：

   • 血液采集与处理： 无菌采集新鲜抗凝全血。离心去除血浆和白细胞层（棕黄层），收集压积红细胞（PRBCs）。
   • 红细胞洗涤： 用生理盐水或PBS轻柔离心洗涤红细胞3-4次，至上清液无色透明，去除残留血浆蛋白和游离血红蛋白。
   • 红细胞悬液配制： 用生理盐水将洗涤后的红细胞配制成一定浓度（通常为2% - 5% v/v）的悬液。
   • 分组与孵育：
     • 设置阴性对照组（生理盐水 + 红细胞悬液）、阳性对照组（如蒸馏水 + 红细胞悬液）、溶剂对照组（如果受试物溶解在非生理盐水溶剂中）、受试物组（不同浓度的受试物溶液 + 红细胞悬液）。每组设平行样（通常n≥3）。
     • 按比例（如4:1）混合受试物溶液/对照液与红细胞悬液于试管中。
     • 轻柔混匀，在设定温度（通常是37°C ± 1°C）下振荡或静止孵育一定时间（常为3小时，也可根据具体标准或产品特性设定，如1、4、24小时）。
   • 终止与离心： 孵育结束后，将试管低速离心（通常750-1000 g，5-10分钟），使未破裂的红细胞沉淀。
   • 上清液收集： 小心吸取上清液，避免扰动沉淀。

3. 溶血程度测定：

   • 分光光度法（最常用）：
     • 将上清液转移至比色皿。
     • 使用分光光度计在血红蛋白最大吸收波长（通常在540 nm左右，或541 nm、577 nm附近有特征峰；也可在414 nm处测定高铁血红蛋白峰以获得更高灵敏度）测定吸光度（OD值）。
     • 计算溶血率： 溶血率 (%) = [(OD受试物 - OD阴性对照) / (OD阳性对照 - OD阴性对照)] × 100%
     • 说明： OD阴性对照代表背景/自发溶血（接近0），OD阳性对照代表100%溶血。该公式校正了背景和仪器响应。
   • 目视比色法（半定量，适用于初步筛选）： 通过与已知溶血程度的标准色卡或系列梯度样品对比上清液颜色（红色深浅）来粗略估计溶血程度。
   • 血红蛋白定量试剂盒： 使用特定的生化试剂（如Drabkin's试剂将血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白，在540 nm测定）进行更精确的定量。

三、 结果判定与解读

1. 溶血率计算： 根据上述公式计算各受试物浓度下的溶血率平均值。
2. 判定标准（常见参考）：
   • 无显著溶血： 溶血率 < 5%。通常认为在此范围内，受试物溶血风险较低。
   • 轻微溶血： 溶血率 ≥ 5% 但 < 10%。需要结合具体应用场景、风险获益比进行评估，可能提示需要进一步研究或关注。
   • 显著溶血： 溶血率 ≥ 10%。通常认为受试物具有不可接受的溶血风险。若为医疗器械或制剂必需成分，需严格论证其必要性与安全性，或进行配方/工艺改良。
3. 浓度效应关系： 分析溶血率随受试物浓度增加的变化趋势，这对于确定安全阈值至关重要。
4. 溶剂对照： 确认所用溶剂本身未引起显著溶血。
5. 阳性/阴性对照有效性： 阳性对照应达到接近100%溶血，阴性对照溶血率应接近0%，否则试验结果无效。

四、 试验关键点与注意事项

1. 红细胞来源与质量： 血液必须新鲜（通常在采集后24-48小时内使用，4°C保存），供体健康，避免溶血性疾病或脂血。洗涤过程需轻柔，避免人为造成机械性溶血。
2. 无菌操作： 试验过程应在洁净环境下进行，防止微生物污染引入干扰。
3. 浓度设置： 受试物浓度需覆盖预期临床暴露浓度或更高范围，以评估潜在风险。应设置多个浓度梯度。
4. 孵育条件： 温度、时间、振荡强度应严格控制并记录，这些因素直接影响结果。
5. 对照组设置： 阳性、阴性、溶剂对照缺一不可，是结果可靠性的保障。
6. 干扰排除：
   • 颜色干扰： 若受试物本身有颜色，需设立仅含受试物和溶剂的空白管（无红细胞），在测定波长处测定其吸光度，并在计算溶血率时扣除：溶血率 (%) = [(OD混合管 - OD样品空白管 - OD阴性对照) / (OD阳性对照 - OD阴性对照)] × 100%
   • 浊度干扰： 受试物导致沉淀或浑浊时，需离心后取上清测OD或更换检测方法。
7. 方法学验证： 试验方法应经过适当的验证（如精密度、准确性、线性范围等）。
8. 遵循标准： 试验应尽量遵循相关的国际、国家或行业标准（如ISO 10993-4（医疗器械）、ICH指南（药物）、各国药典附录等）。

五、 应用与意义

1. 药物研发： 筛选候选药物，评估注射剂、滴眼液等非口服制剂的血液相容性，是申报临床前安全性评价的重要组成部分。
2. 医疗器械评价： 评估与血液直接或间接接触的医疗器械（如导管、透析器、人工心脏瓣膜、骨科植入物等）的生物相容性（根据ISO 10993-4要求）。
3. 生物材料安全性评价： 评估用于组织工程、药物载体等的生物降解材料、纳米材料等的血液相容性。
4. 化妆品及化学品评价： 评估某些可能经皮肤吸收或意外接触血液的物质的潜在溶血性。
5. 质量控制： 用于某些血液制品或生物制品的放行检验。

六、 局限性

• 体外局限性： 试验在简单的体外系统中进行，不能完全模拟体内复杂的生理环境（如血流剪切力、血浆蛋白结合、代谢转化、免疫系统清除等）。
• 预测价值： 阳性结果（显著溶血）强烈提示体内风险，需高度警惕。阴性结果不能完全保证体内无溶血风险，仍需结合其他体内外试验（如体内溶血试验、网织红细胞计数、游离血红蛋白测定等）和临床研究进行综合评价。
• 机制复杂性： 溶血可能是多种机制共同作用的结果，体外试验难以完全解析。

结论：

体外溶血试验是评估药物、医疗器械和生物材料血液相容性的关键初筛工具。其操作相对简便、快速、成本较低且避免了不必要的动物实验。通过标准化操作、严格对照设置和合理的浓度设计，该试验能有效识别具有溶血潜力的物质。然而，其结果应谨慎解读，认识到体外模型的局限性。显著的体外溶血结果是重要的风险信号，需要进一步研究；阴性结果则需结合更全面的评价体系来最终判定产品的临床安全性。该试验在保障人类用药用械安全方面发挥着不可替代的基础性作用。