小鼠骨髓微核试验

发布时间：2025-06-16 11:58:53 阅读量：3 作者：生物检测中心

小鼠骨髓微核试验：原理、操作与评价

一、引言

小鼠骨髓微核试验（Mammalian Bone Marrow Micronucleus Test）是遗传毒理学研究中一项经典、可靠的体内试验方法。它主要用于检测化学物质或物理因素对哺乳动物体细胞染色体造成的损伤（断裂、丢失）或纺锤体功能干扰（导致整条染色体滞后），这种损伤在细胞分裂后期会形成微核。微核是存在于细胞质中、独立于主核之外的圆形或椭圆形小核，其直径通常小于主核的1/3，结构与主核一致（含DNA）。因其简便、快速、灵敏，该试验广泛应用于药品、化学品、食品添加剂、化妆品原料及环境污染物等的遗传毒性初筛和评价。

二、试验原理

  1. 靶细胞： 骨髓中的未成熟红细胞（嗜多染红细胞, PCE）。这类细胞在分裂成熟排出主核成为成熟红细胞（NCE）前的短时间内，细胞质中残留的微核清晰可见且易于观察。
  2. 损伤机制：
    • 染色体断裂剂： 诱导染色体断裂形成无着丝粒片段，在细胞分裂后期不能移向两极，滞留在细胞质中形成微核。
    • 非整倍体诱变剂： 干扰纺锤体功能（如影响微管组装），导致整条染色体在分裂后期不能正常分离而滞后，最终形成微核。
  3. 检测终点： 计数骨髓PCE细胞中含微核的细胞频率（微核率，MNR），以此评价受试物诱发骨髓细胞染色体损伤的能力。

三、材料与试剂

  1. 实验动物： 通常选用健康成年小鼠（推荐使用SPF级），品系可选择昆明小鼠、ICR小鼠、C57BL/6等常用品系。每组动物数量应足够（通常每组≥5只），雌雄可兼用或根据特定要求选择单一性别。动物体重差异不宜过大。试验前需适应性饲养数日。
  2. 受试物： 根据试验目的配制适当浓度的溶液或混悬液。常用溶剂/载体包括生理盐水、蒸馏水、植物油（如玉米油）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水溶液、二甲基亚砜（DMSO）等。需确保溶剂/载体本身无遗传毒性，且不影响受试物溶解/稳定性。
  3. 阳性对照物： 用于验证试验系统的敏感性。常用选择：
    • 染色体断裂剂：环磷酰胺（Cyclophosphamide, CP），腹腔注射。
    • 非整倍体诱变剂：秋水仙碱（Colchicine）。
  4. 阴性对照物： 给予等体积的溶剂/载体。
  5. 骨髓采样试剂：
    • 胎牛血清（或小牛血清）：用于制备骨髓细胞悬液，保护细胞。
    • 甲醇（固定剂）。
    • 吉姆萨（Giemsa）染液或阿利新蓝（Acridine Orange, AO）染液（荧光染色）。
    • PBS缓冲液（磷酸盐缓冲生理盐水），pH 6.8。
    • May-Grünwald 染液（可选）。
  6. 主要器材：
    • 解剖器械（剪刀、镊子）。
    • 注射器及针头（用于给药、骨髓冲洗）。
    • 载玻片、盖玻片。
    • 离心机、离心管。
    • 细胞计数器（血球计数板）。
    • 光学显微镜（配备油镜镜头）或荧光显微镜（若用AO染色）。
    • 冰箱、生物安全柜。

四、试验设计与操作步骤

  1. 动物分组与编号： 随机将动物分为若干组：阴性对照组、阳性对照组（1-3个剂量组）、受试物组（通常设3个剂量组）。动物称重、编号。
  2. 剂量选择： 受试物剂量设计至关重要。
    • 高剂量应能诱导明显的细胞毒性（骨髓PCE/NCE比值下降，通常要求比值>0.1），但不应引起动物过度痛苦或死亡（死亡率≤10%）。可通过预试验确定最大耐受剂量（MTD）。
    • 中、低剂量一般为高剂量的1/2或1/4，呈等比或等差关系。
    • 阳性对照组给予已知有效剂量的阳性物（如环磷酰胺40-100 mg/kg bw）。
    • 阴性对照组给予溶剂/载体。
  3. 给药途径与体积： 常用腹腔注射（i.p.）或经口灌胃（p.o.）。注射/灌胃体积通常为5-10 mL/kg bw，最大不超过20 mL/kg bw。
  4. 给药方案（经典方案）：
    • 多次给药法（推荐）： 每天给药一次，连续给药2天（或根据药代动力学延长）。末次给药后约24小时采样。此法对S期依赖物更敏感，符合多数标准要求。
    • 单次给药法： 单次给药后，在多个时间点（如24h, 48h）采样，或在峰值时间（如24h）采样。灵敏度可能略低于多次给药法。
  5. 骨髓采样（颈椎脱臼法处死动物）：
    • 处死动物后，迅速剥离股骨或胸骨。
    • 剪去股骨两端，用装有少量胎牛血清的1 mL注射器冲出骨髓腔内的细胞至离心管中（或用针头轻轻刮取胸骨骨髓）。
    • 轻柔吹打制成均匀细胞悬液。
  6. 细胞悬液制备与涂片：
    • 低转速（约1000 rpm, 5分钟）离心骨髓细胞悬液。
    • 弃去大部分上清，保留少量液体将细胞沉淀重悬。
    • 取少量细胞悬液滴于清洁载玻片一端。
    • 用另一张载玻片以约45度角将细胞悬液迅速推成薄而均匀的骨髓涂片。自然晾干。
  7. 固定与染色：
    • 固定： 将晾干的涂片浸入甲醇中固定5-10分钟，取出晾干。
    • 染色（以Giemsa为例）：
      • 用新鲜配制的10% Giemsa染液（用PBS或pH 6.8缓冲液稀释）染色15-20分钟。
      • 流水轻轻冲去染液（避免直接冲刷涂片）。
      • 晾干。
    • （若用AO荧光染色）: 涂片晾干后用AO染液染色，PBS冲洗，甘油封片，荧光显微镜观察。
  8. 阅片与计数：
    • 光学显微镜下（油镜，1000倍），寻找染色良好、细胞分散均匀的区域。
    • 区分细胞类型：
      • 嗜多染红细胞（PCE）：体积略大于成熟红细胞，胞质呈灰蓝色或淡蓝色。
      • 成熟红细胞（NCE）：体积小，胞质呈淡红色或橘黄色，无核。
      • 有核细胞：胞质通常不着色或染色浅，有深染的细胞核。
    • 计数微核：
      • 微核位于PCE细胞质内，呈圆形或椭圆形，边缘光滑清晰，染色特性与主核一致（Giemsa染色呈深紫红色），直径通常为主核的1/20至1/5。
      • 需与染料沉渣、细菌等杂质区分。
    • 计数规则（每只动物）：
      • 至少观察计数1000个PCE细胞（最好2000个），记录其中含微核的PCE数（即微核PCE数）。
      • 同时计数200个（最好500个）红细胞（PCE + NCE），计算PCE在总红细胞中所占的比例（PCE/(PCE+NCE)），作为反映骨髓细胞增殖抑制（细胞毒性）的指标。阴性对照组该比值通常在0.6以上。受试物高剂量组此比值应不低于0.20（或0.10，依据不同指导原则要求）。

五、数据处理与结果评价

  1. 数据记录： 详细记录每组每只动物的：
    • 含微核的PCE数（MNPCE）
    • 计数的PCE总数
    • 计数的红细胞总数（PCE + NCE），计算出PCE比率（PCE%）
    • 微核率（MNR） = （某动物MNPCE数 / 该动物计数的PCE总数） × 1000 ‰ (千分率表示)
  2. 统计分析：
    • 细胞毒性指标： 比较各剂量组与阴性对照组的PCE%是否存在统计学显著下降（如t检验、方差分析）。
    • 微核率：
      • 首先比较组内动物的个体数据是否存在异常离散（如泊松分布检验）。
      • 若数据符合参数检验前提（正态性、方差齐性），采用方差分析（ANOVA）后多重比较（如Dunnett's test）。
      • 若数据不符合参数检验前提，则采用非参数检验（如Kruskal-Wallis H检验后Dunn's test或Mann-Whitney U检验）。
    • 阳性对照组微核率必须显著高于阴性对照组（P<0.05），否则试验无效。
  3. 结果判定：
    • 阴性结果： 各剂量组微核率与阴性对照组相比无统计学显著增加（P>0.05），且在高剂量组显示出足够的细胞毒性（PCE%显著下降）。
    • 阳性结果： 至少一个剂量组微核率与阴性对照组相比有统计学显著增加（P<0.05），并存在剂量-反应关系（非必须，但增强说服力）。
    • 可疑结果： 微核率有增加趋势但未达显著水平，或结果难以解释（如仅在最高剂量有微弱增加但细胞毒性巨大）。需谨慎判断或重复试验。
    • 无效结果： 阳性对照组结果不符合预期要求（未显著升高），或阴性对照组本底过高，或试验操作存在明显失误。

六、注意事项与局限性

  1. 伦理与动物福利： 试验必须遵循实验动物福利伦理原则，通过相关伦理审查委员会（IACUC）审批。给予人道关怀，尽量减少动物痛苦。
  2. 质量控制：
    • 严格操作规程，避免人为误差（如涂片厚薄不均、染色过度/不足、细胞鉴别错误）。
    • 阅片人员应经过良好培训，阅片时采用盲法（不知晓分组信息）。
    • 定期核对阅片结果的一致性（组内、组间）。
    • 阴性对照组微核率应在该实验室历史本底范围（通常<3‰）。
  3. 局限性：
    • 组织特异性： 主要反映骨髓细胞的染色体损伤，不能直接代表其他组织（如肝脏、生殖细胞）的损伤情况。
    • 代谢差异： 小鼠的代谢酶系统与人类存在差异，可能导致假阴性或假阳性。
    • 某些损伤检出受限： 对于主要作用于特定组织、代谢活化复杂的化合物，或非整倍体诱变剂的敏感性有时不及体外试验。
    • 无法区分断裂剂与非整倍体诱变剂： 需结合其他试验（如体外微核试验加CREST染色或纺锤体检测试验）进行鉴别。
  4. 生物安全： 操作潜在遗传毒物或生物样本时，严格遵守实验室生物安全规范，佩戴个人防护装备（手套、口罩、实验服），在生物安全柜内进行可能产生气溶胶的操作，废弃物按规定处理。

七、应用与价值

小鼠骨髓微核试验作为遗传毒性标准组合（通常包括Ames试验、体外染色体畸变试验/体外微核试验、体内微核试验）中的核心体内试验，具有不可替代的重要性：

  1. 体内验证： 提供受试物在整体动物水平能否到达靶组织（骨髓）并引起遗传损伤的直接证据，弥补体外试验缺乏代谢和药代动力学等因素的不足。
  2. 综合毒性评价： 同时评估遗传毒性和细胞毒性。
  3. 风险评价： 为受试物的遗传毒性风险评估提供关键数据，支持其在药品注册、化学品登记、食品安全评估等领域的决策。

八、结论

小鼠骨髓微核试验方法成熟可靠，是评价化学物体内遗传毒性的重要工具。通过严谨的实验设计、规范的操作流程、准确的数据分析和科学的评价标准，能够有效地检测受试物诱发哺乳动物体细胞染色体损伤的潜力，为保障人类健康和环境安全提供科学依据。研究者应充分理解其原理、方法和局限性，并结合其他试验结果进行综合判断。