哺乳动物细胞体外染色体畸变试验

1. 引言 哺乳动物细胞体外染色体畸变试验是遗传毒理学领域一项重要的短期体外试验，主要用于评估受试物（如化学品、药物、环境污染物等）是否能诱发哺乳动物细胞的染色体结构或数目异常。染色体畸变（包括断裂、缺失、交换、环状染色体、多倍体等）是细胞遗传物质损伤的直接表现，与致癌、致突变风险高度相关。该试验遵循国际经济合作与发展组织（OECD）测试指南第473号（TG 473）等国际公认标准，广泛应用于药物安全评价、化学品风险评估及基础遗传学研究。

2. 试验原理 处于增殖期的哺乳动物细胞体外培养体系中暴露于受试物。若受试物具有遗传毒性，可能干扰DNA、阻碍有丝分裂过程或直接损伤染色体结构，导致细胞在后续的有丝分裂中期相出现可观察到的染色体异常（畸变）。通过显微镜计数和分析中期相细胞的染色体畸变率，即可评价受试物的致染色体畸变潜力。

3. 关键试验要素

细胞模型：
- 首选细胞系： 常用的有中国仓鼠肺成纤维细胞（如CHL、V79、CHO细胞系）或中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞系）。这些细胞具有稳定的核型、较短的细胞周期和相对清晰的染色体形态。
- 人类细胞： 也可使用人外周血淋巴细胞（需植物血凝素PHA刺激增殖）或其他经过验证的人类细胞系（如TK6细胞）。使用人细胞可能增强与人类风险相关性。
试验设计：
- 重复性： 设置独立的重复培养物。
- 剂量组： 设立多个受试物浓度组（通常至少3个检测浓度，间距合理），一个溶剂/空白对照组，以及一个阳性对照组。
- 处理方式：
  - 短期处理（加或不加代谢活化系统）：
    - 无代谢活化（-S9）： 直接暴露于受试物，通常处理3-6小时，然后更换新鲜培养液，继续培养至细胞收获（涵盖一个半到两个细胞周期）。
    - 有代谢活化（+S9）： 暴露于受试物与啮齿类动物（通常为大鼠）肝来源的代谢活化系统（S9混合液）混合物中，处理3-6小时，模拟体内代谢过程。之后移除含S9的培养液，洗涤细胞，更换新鲜培养液并继续培养至收获。
  - 连续处理（不加S9）： 在整个试验期间持续暴露于受试物（通常覆盖1.5-2个细胞周期），适用于不依赖代谢活化或代谢物具有较长半衰期的受试物。
代谢活化系统 (+S9 Mix)：
- 体外试验系统通常缺乏完整的哺乳动物代谢酶系。加入外源性代谢活化系统（通常是大鼠肝匀浆上清液S9组分与辅助因子的混合物）可模拟肝脏的Ⅰ相代谢作用，将某些前致突变物/前致癌物转化为具有遗传毒性的活性形式。
阳性与阴性对照：
- 阳性对照： 应设置已知的染色体畸变诱导剂作为阳性对照。
  - 无代谢活化（-S9）常用：丝裂霉素C、甲磺酸乙酯（EMS）、甲磺酸甲酯（MMS）等。
  - 有代谢活化（+S9）常用：环磷酰胺（CP）、苯并[a]芘（BaP）等。
- 阴性/溶剂对照： 使用与溶解受试物相同的溶剂（如生理盐水、DMSO、培养液），浓度与最高剂量组溶剂浓度一致。
中期相细胞的阻断与收获：
- 在预定收获时间（通常在处理后1.5-2个细胞周期）前数小时加入纺锤体抑制剂（常用秋水仙素或其衍生物秋水仙胺）。
- 其作用是阻断细胞分裂于有丝分裂中期（M期），使染色体高度凝缩，便于观察和分析。
细胞收获与玻片制备：
1. 低渗处理： 使用低渗溶液（如0.075 M KCl）处理细胞，使细胞吸水膨胀，促使染色体分散。
2. 固定： 使用固定液（甲醇:冰醋酸=3:1）多次固定细胞，去除水分并保持染色体形态。
3. 滴片： 将细胞悬液滴于洁净玻片上，空气干燥。
4. 染色： 通常使用吉姆萨（Giemsa）染色液染色，使染色体着色清晰可见。
染色体畸变分析：
- 在光学显微镜下（通常油镜，1000倍）系统性地筛选形态良好的中期分裂相细胞。
- 畸变类型识别与计数：
  - 染色体型畸变： 涉及两条染色单体在同一位置发生损伤（常发生在细胞周期的G1期或S早期）。
    - 断裂型畸变： 染色体断裂（无着丝粒断片）、染色体缺失（末端缺失、微小体）。
    - 交换型畸变： 双着丝粒体、环状染色体（着丝粒环、无着丝粒环）、相互易位（复杂情况下不易检出）、插入。
    - 裂隙： 染色单体上小于染色体宽度的非染色区域，通常单独记录，其意义存在争议。
  - 染色单体型畸变： 仅涉及一条染色单体的损伤（常发生在细胞周期的S期或G2期）。如染色单体断裂、染色单体交换（单体互换）。
  - 数目畸变（非整倍体/多倍体）： 主要作为附加信息记录，明确区分于结构畸变分析。
- 分析标准： 通常分析每个剂量组和对照组100个（或OECD规定至少200个）可评价的中期分裂相细胞。记录含畸变的细胞数、畸变细胞的类型和数量。计算畸变细胞百分比和每个细胞的畸变数。
- 畸变确认： 对复杂畸变需谨慎判断并记录清晰。
细胞毒性评估：
- 试验过程中需监测细胞毒性（如相对细胞计数、有丝分裂指数MI降低、细胞融合度变化等）。
- 最高剂量组应达到一定的毒性水平（如细胞生长抑制约50%（相对细胞计数下降至50%左右），或有丝分裂指数显著下降），但不应引起培养物过度损伤（如细胞过度死亡）。
- 剂量设置上限通常为：溶解度允许的最大浓度、1mM或0.5mg/ml（固体）、0.1μl/ml（液体），以先达到者为准，且需满足细胞毒性要求。
数据评估与结果判定：
1. 试验有效性：
  - 溶剂/空白对照组畸变率应在实验室历史背景数据范围内（通常畸变细胞率<5%）。
  - 阳性对照组的畸变率必须显著高于对照组，证明试验系统对诱变剂的响应良好。
  - 剂量依赖关系或可重复性的显著增加通常表明阳性效应。
2. 统计学分析： 采用适当的统计学方法（如卡方检验、Fisher精确检验、趋势检验）比较各剂量组与对照组的畸变细胞率是否有显著性差异。
3. 生物学意义： 统计学显著性是基础，但最终判定需结合剂量-反应关系、畸变类型（交换型畸变权重更高）、重复性及历史对照数据等进行生物学意义评估。
4. 结果判定：
  - 阳性结果 (+)： 在一个或多个剂量组观察到染色体畸变细胞率呈现剂量依赖性增加和/或统计学显著增加（通常p<0.05），并且这种增加被认为具有生物学意义（非偶然）。
  - 阴性结果 (-)： 在任何剂量组均未观察到染色体畸变细胞率呈现剂量依赖性增加或统计学显著增加。
  - 不确定结果： 数据不足以明确分类为阳性或阴性（例如毒性过大干扰分析、结果模棱两可等）。

4. 试验的优势与局限性

优势：
- 直接观察遗传物质的损伤终点（染色体水平）。
- 快速、相对经济（与体内试验相比）。
- 可控制暴露条件（浓度、时间）。
- 可加入代谢活化系统评估间接诱变剂。
- 检测多种类型的染色体结构损伤（断裂、交换等）。
- 国际高度标准化（OECD 473， ICH S2(R1）），结果具有可比性。
局限性：
- 体外系统： 缺乏完整的吸收、分布、排泄过程及体内平衡机制。
- 高浓度暴露： 使用接近毒性的高浓度，可能与体内暴露水平不匹配，存在假阳性风险（如极端pH、高渗透压、严重细胞毒性等间接效应）。
- 代谢活化局限性： S9混合液仅模拟Ⅰ相代谢，缺乏Ⅱ相代谢（解毒作用），且种属差异无法完全代表人类代谢。
- 敏感性差异： 不同细胞系对特定诱变剂的敏感性可能不同。
- 无法检测所有遗传损伤： 对基因突变、非整倍体诱导（需特殊分析）灵敏度有限。

5. 结论 哺乳动物细胞体外染色体畸变试验是评估化学品和药物遗传毒性风险的关键组成部分。它能有效检测直接或经代谢活化后间接诱导的染色体结构畸变。阳性结果表明受试物具有致染色体断裂和重排的潜能，提示其可能具有遗传毒性和潜在的致癌风险，需进一步进行体内试验评估。阴性结果则表明在该试验条件下未检测到致染色体畸变作用。结果解释需结合其优势与局限性，并整合到遗传毒性标准试验组合（通常还包括细菌回复突变试验和体内微核试验）中综合评估。

6. 参考文献（核心依据）

OECD Guideline for the Testing of Chemicals, No. 473: In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test. (Adopted July 2016).
ICH Harmonised Guideline S2(R1) Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use (Step 4 version, November 2011).
Preston, R. J., et al. (1981). Mammalian in vivo and in vitro cytogenetic assays: A report of the U.S. EPA's Gene-Tox Program. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, 87(2), 143-188. (经典综述)
Ishidate Jr, M., et al. (1988). Primary mutagenicity screening of food additives currently used in Japan. Food and Chemical Toxicology, 26(6), 487-500. (方法学重要参考)

注意： 实际实施此试验需在符合良好实验室规范（GLP）的实验室中进行，以确保数据的质量和可靠性。