生育力与早期胚胎发育毒性试验

生育力与早期胚胎发育毒性试验 (ICH S5(R3) 阶段 A)

1. 试验目的： 本试验旨在评估受试物（药物、化学物质等）对成年动物生育力和早期胚胎发育的潜在不良影响。具体目标包括：

• 生育力影响： 评估对配子（精子、卵子）生成、成熟、释放、运输以及交配行为的影响。
• 生殖功能影响： 评估对性激素水平、发情周期、交配率、受孕率的影响。
• 早期胚胎发育影响： 评估对受精卵形成、卵裂、输卵管运输、子宫着床直至着床完成（通常到大鼠妊娠第6天）的影响。
• 区分性别特异性效应： 识别影响主要发生在雄性还是雌性亲代动物。
• 为后续发育毒性试验提供剂量参考： 确定对亲代无明显严重毒性的剂量水平，用于后续胚胎-胎仔发育毒性试验（ICH S5(R3) 阶段 C）的剂量设计。

2. 试验设计原则 (依据 ICH S5(R3))：

• 动物种属： 首选大鼠（通常为 Sprague-Dawley、Wistar Han 等品系），因其繁殖力强、发情周期稳定、背景数据丰富且经济实用。若大鼠不适用（如药理学作用不适），可考虑其他啮齿类（如小鼠）或非啮齿类（如兔）。需说明理由。
• 动物数量与分组：
  • 每组应有足够数量的雄性和雌性动物，以在试验结束时获得足够数量的交配对和孕鼠用于有意义的统计分析。通常每组至少包含 16-20 只有效交配成功的雌鼠（确保每组有足够孕鼠评估着床情况）和相应数量的雄鼠（通常每组至少 16-24 只雄鼠）。需考虑预期的交配率和受孕率。
  • 至少设置三个剂量组和一个溶媒/赋形剂对照组。剂量应等间距设置（如对数等距）。
• 给药途径： 应采用预期的人体暴露途径（如口服灌胃、静脉注射、皮下注射等）。若临床拟用途径在动物上不可行或不合适，需选择可提供充分系统暴露的替代途径，并说明理由。
• 给药方案：
  • 雄性动物： 在交配开始前开始给药，持续整个交配期（通常至少覆盖精子发生的完整周期，大鼠约为 4-6 周）。通常在大鼠中，交配前给药至少 4 周（覆盖精原细胞发育为成熟精子所需时间）。
  • 雌性动物： 在交配开始前开始给药（通常至少覆盖 2 个完整的发情周期，大鼠约 2 周），并持续至妊娠第 6 天（GD6）（覆盖排卵、受精、早期胚胎发育、输卵管运输和着床完成的关键时期）。
  • 频率： 通常每日给药一次，但需根据受试物的药代动力学特性调整。
• 交配：
  • 经过足够给药期后（确保雄鼠精子发生周期被覆盖，雌鼠经历足够给药的发情周期），将给药的雄鼠与同剂量组的雌鼠按 1：1 比例合笼交配（避免混淆个体效应）。
  • 每日早晨检查雌鼠阴道涂片或栓子（大鼠），以确认交配发生（以发现阴道栓或精子的日期记为妊娠第 0 天， GD0）。
  • 首选顺序交配设计（即一只雄鼠与多只雌鼠顺序交配），但需确保雄鼠有足够休息时间。也可配对设计（一雄一雌）。
  • 设定合理的交配期限（如大鼠通常为 2-3 周），未交配的动物可进行二次交配（需在报告中说明）。
• 观察终点：
  • 亲代动物：
    • 临床症状： 每日至少一次，观察外观、行为、活动、排泄物、有无中毒体征等。
    • 体重及体重变化： 给药前称重，给药期间及交配期间至少每周称重一次（雌性在交配期和妊娠早期需更频繁），是生殖毒性敏感指标。
    • 摄食量： 给药期间至少每周记录一次，评估受试物对一般状态的影响。
    • 交配行为与生育力指标：
      • 交配率（成功交配的动物对数 / 合笼动物对数 x 100%）。
      • 交配时间（从合笼到交配成功的天数）。
      • 受孕率（有阴道栓/精子且解剖证实妊娠的雌鼠数 / 成功交配雌鼠数 x 100%）。
    • 雌性特有指标： 给药期间（交配前阶段）、交配期及 GD0-GD6 的发情周期情况（通过阴道细胞学评估）。
    • 雄性特有指标（可选但强烈推荐）： 试验结束时（雌性确认妊娠或交配期结束后），对雄性进行尸检，评估主要生殖器官（睾丸、附睾、精囊腺、前列腺等）重量（称重并计算脏器系数）和组织病理学检查（重点评估睾丸生精小管结构、各级生精细胞、间质细胞；附睾精子储存）。在关键的雄性生殖毒性评价中，强烈建议进行附睾尾精子分析（精子计数、活力、形态学）。
  • 胚胎着床分析：
    • 在妊娠第 13 天左右（大鼠 GD13，此时着床位点清晰可见）将雌性动物安乐死，剖腹检查子宫。
    • 计数两侧子宫角的黄体数（代表排卵数）。
    • 计数两侧子宫角的着床总数（包括活胚胎、死胚胎、吸收痕，表现为子宫壁上的隆起或斑点）。
    • 计算着床前丢失率：（黄体数 - 着床总数） / 黄体数 x 100%。
    • 计算着床后丢失率（早期胚胎死亡）：（着床总数 - 活胚胎数） / 着床总数 x 100%。注意：本试验阶段终止于 GD13 左右，此时仅能区分活胚胎（有胎心搏动、发育正常）和早期死亡胚胎（吸收痕、残骸）。详细胎仔畸形检查属于阶段 C 胚胎-胎仔发育毒性试验的内容。
• 剂量选择：
  • 高剂量： 应旨在产生亲代毒性（如体重增长抑制、特定靶器官毒性、甚至轻度死亡率），但不应引起过度痛苦或显著影响交配行为（否则无法评估生育力）。剂量探索试验（剂量范围确定试验）对此至关重要。
  • 中、低剂量： 应旨在产生轻微的毒性或无可见不良反应水平（NOAEL）。低剂量通常接近或等同于预期的人体暴露水平（需考虑安全系数）。
  • 对照组： 给予溶媒或赋形剂，处理方式与给药组相同。
• 试验终点：
  • 雄性：在雌性确认妊娠或交配结束时（未交配成功或未受孕），处死进行解剖和器官采集（生殖器官、潜在靶器官）。
  • 雌性：在 GD13 左右处死进行着床情况检查和解剖（生殖器官、潜在靶器官）。

3. 数据记录与分析：

• 详细记录所有观察结果、原始数据（体重、摄食量、脏器重量、黄体数、着床数等）。
• 数据应进行适当的统计学分析（根据数据分布特性选择参数或非参数方法），比较各剂量组与对照组之间的差异。常用方法包括方差分析（ANOVA）加 Dunnett’s 检验、卡方检验、Fisher 精确检验等。
• 分析应包括：
  • 亲代毒性（体重、摄食、临床症状、死亡率、非生殖器官病理变化）。
  • 生育力参数（交配率、交配时间、受孕率）。
  • 生殖器官重量及病理学发现（尤其是雄性）。
  • 精子分析结果（如进行）。
  • 雌性发情周期变化。
  • 黄体数、着床总数、着床前丢失率、活胚胎数、着床后丢失率。

4. 结果解释与报告：

• 报告应清晰呈现所有数据和分析结果（文字、表格、图表）。
• 评估受试物是否对亲代生育力（精子发生、卵泡发育、激素水平、交配行为、受孕能力）产生不良影响。
• 评估受试物是否影响早期胚胎发育（受精、卵裂、运输、着床）。
• 确定产生生殖毒性的剂量水平（LOAEL）和无生殖毒性作用的剂量水平（NOAEL）。
• 讨论观察到的效应性质、剂量反应关系、性别特异性（主要影响雄性还是雌性）。
• 将生殖器官病理变化、精子参数变化（如进行）与生育力结果联系起来分析。
• 评估结果的生物学意义和潜在的临床相关性。
• 明确指出本试验结果为后续胚胎-胎仔发育毒性试验（阶段 C）推荐的剂量水平。

5. 讨论与局限性：

• 物种差异： 动物结果外推到人类存在固有的局限性。
• 检测灵敏度： 相对较小的实验动物群体可能无法检测出低发生率的效应。
• 雄性评估： 仅依靠生育力终点（受孕率）评估雄性生殖毒性不够敏感。组织病理学检查是核心，附睾精子分析能显著提高检测雄性生殖毒性的灵敏度和提供机制信息，应尽量包含。
• 内分泌干扰： 本试验可检测部分由内分泌干扰引起的效应（如发情周期紊乱），但专门的内分泌功能检测可能需要附加试验。
• 着床后发育： 本试验不评估 GD6 之后器官形成期和胎仔发育期的毒性（此部分由阶段 C 试验覆盖）。

结论： 生育力与早期胚胎发育毒性试验（ICH S5(R3)阶段A）是生殖毒性标准组合试验（I、II、III段）的第一阶段关键组成部分。它系统地评估了受试物对成年动物从配子发生到受精、着床完成这一关键生殖阶段的影响，为识别潜在的生殖危害、理解作用机制以及指导后续发育毒性试验的设计提供了必不可少的信息。试验设计严格遵循ICH S5(R3)指南的核心原则，重点关注生育力参数、亲代生殖器官病理、雌性发情周期、早期胚胎着床情况以及必要的精子分析。其结果对于全面评价受试物的生殖安全性至关重要。