血浆稳定性实验：确保分析可靠性的关键环节
血浆作为临床检验和药物研发中最常用的生物样本之一，其内含分析物（如药物、代谢物、蛋白质、激素等）在采集、处理、储存及分析前的稳定性，直接影响实验结果的准确性和可靠性。因此，进行系统、科学、规范的血浆稳定性实验是生物分析领域不可或缺的关键步骤。
一、 实验目的与意义
血浆稳定性实验的核心目标是：评估目标分析物在特定实验条件下（模拟实际样本处理和分析过程中的各种环境和时间因素）保持其原始浓度或活性的能力。 其重要意义在于：
- 保证数据准确可靠： 确认分析物在实验全流程中未发生显著降解或转化，避免因样本不稳定导致的分析偏差（假阳性或假阴性）。
- 验证分析方法： 是新方法开发和验证（如生物分析方法验证GLP/GCP）的重要内容，确保方法能准确测定真实浓度。
- 指导样本处理与储存： 为临床采样、样本运输、实验室前处理（离心、分装）以及短期/长期储存条件（温度、时间）提供科学依据和操作规程。
- 支持法规要求： 满足药品监管机构对于生物样本分析数据完整性和可靠性的合规性要求。
二、 核心稳定性考察维度
血浆稳定性实验通常涵盖以下几个关键维度：
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室温稳定性：
- 目的： 评估血浆样本在采血后、处理前（如等待离心）以及分析过程中（如自动进样器内停留）在室温（通常指15-25°C）下的稳定性。
- 方法： 将新鲜采集并抗凝处理的混合血浆样本（含目标分析物）置于室温下，在不同时间点（如0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、24小时，根据实际流程设定）取样进行分析。与0小时（即时处理）的结果进行比较。
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冷藏稳定性：
- 目的： 评估血浆样本在冰箱（通常2-8°C）短期储存（如过夜保存、运输过程中的冷藏）下的稳定性。
- 方法： 将血浆样本置于2-8°C冷藏，在不同时间点（如0小时、24小时、48小时、72小时、1周）取样分析，与0小时冷藏样本或新鲜处理样本比较。
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冷冻/冻融稳定性：
- 目的： 评估血浆样本经历多次冻融循环（从冷冻状态解冻到室温或冷藏状态，再重新冷冻）对分析物的影响。这对于长期储存样本的反复使用至关重要。
- 方法： 将血浆样本在设定的冷冻温度（通常-20°C或-70°C/-80°C）下储存一定时间。然后取出，在室温或冷藏条件下完全解冻。解冻后取样分析（代表一次冻融），剩余样本立即或在室温/冷藏下保持一段时间后，再次冷冻。重复此过程多次（通常至少3次）。每次冻融循环后均需分析，并与未冻融或首次冻融前的基准样本比较。
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长期冷冻稳定性：
- 目的： 评估血浆样本在设定的长期储存温度（通常-20°C、-70°C或-80°C）下储存较长时间（数月甚至数年）后的稳定性。这是支持生物样本库和回顾性研究的基础。
- 方法： 将血浆样本分装后立即置于目标冷冻温度下长期储存。在预定的时间点（如1个月、3个月、6个月、1年、2年等）取出部分样本，解冻并分析。与储存开始时（T0）冻存的基准样本或新鲜配制的标准品质控样本（在相同条件下储存）进行比较。通常需要设置多个时间点以考察稳定性随时间的变化趋势。
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处理后样品（提取后/进样前）稳定性：
- 目的： 评估经过样品前处理（如蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取）后的待测溶液（上清液、洗脱液、重组溶液），或在分析仪器（如HPLC自动进样器）中等待进样时的稳定性。
- 方法： 将处理完成后的样品置于设定的条件（如自动进样器温度，通常4-10°C或室温）下，在不同时间点（如0小时、6小时、12小时、24小时、48小时）进样分析。与0小时（即处理后立即分析）的结果进行比较。
三、 实验设计关键要素
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样本制备：
- 使用新鲜采集的健康人或含目标分析物（添加已知浓度）的混合人血浆。选择合适的抗凝剂（如EDTA、肝素、枸橼酸钠等，需与研究目的和分析物兼容）。
- 采集后应在规定时间内（根据室温稳定性结果确定）进行离心分离血浆，避免溶血。
- 实验前充分混匀样本。
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分析物浓度设置：
- 通常设置低浓度（接近定量下限LLOQ） 和高浓度（接近定量上限ULOQ） 两个水平的样本进行考察。低浓度对降解更敏感，高浓度考察范围的代表性。
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对照设置：
- T0对照： 即时处理/即时分析的样本（或冻存的基准样本），作为稳定性的参考基准。
- 新鲜配制对照品/质控品： 用于长期稳定性考察，排除分析批间差异的影响。
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时间点设置：
- 应涵盖并超过实际样本可能经历的最长时间。例如，室温稳定性应覆盖采血到离心的最长时间+分析过程最长可能等待时间。
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重复测定：
- 每个时间点的每个浓度水平应进行多次重复分析（通常n≥3），以保证结果的统计学意义。
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储存条件：
- 精确控制并记录温度（使用校准过的温度计或记录仪）。
- 避免光照（尤其对光敏感的分析物），可使用棕色管或铝箔包裹。
- 分装储存，避免反复冻融非实验设计的样本。
四、 数据处理与接受标准
- 计算： 计算各时间点、各浓度水平样本测定结果的平均值和标准差。
- 比较： 将各时间点的平均值与基准值（T0或新鲜对照）进行比较。
- 接受标准（普遍参考）：
- 各时间点测定结果的平均值与基准值的相对偏差（% Bias） 应在±15%范围内（在LLOQ处可为±20%）。
- 结果的精密度（%RSD） 通常应≤15%（在LLOQ处可为≤20%）。
- 如果稳定性考察期间包含多个分析批次，数据应证明分析批次间无明显差异。
- 趋势分析： 无明显随时间递增或递减的降解趋势。
五、 实验报告
完整的血浆稳定性实验报告应清晰记录：
- 实验目的。
- 目标分析物名称。
- 血浆来源、抗凝剂类型。
- 考察的稳定性维度（室温、冷藏、冻融次数、长期温度及时间点等）。
- 分析物浓度水平。
- 详细的实验方案（样本处理、储存条件、时间点设置、分析方法）。
- 原始数据和统计分析结果（平均值、标准差、%Bias、%RSD）。
- 图表（如稳定性趋势图）。
- 明确的结论（分析物在特定条件下是否稳定，以及稳定的具体时间范围）。
六、 案例要点举例（某化合物分析）
- 室温稳定性： 实验证明含该化合物的血浆在室温下稳定至少6小时，满足采血后常规离心和处理所需时间。
- 冷藏稳定性： 样本在2-8°C冷藏条件下稳定至少72小时，支持短期冷藏储存或运输。
- 冻融稳定性： 经历3次完整的冻融循环（-80°C冷冻，室温解冻）后，化合物浓度变化在±10%以内，符合接受标准。
- 长期冷冻稳定性： 在-80°C储存条件下，该化合物在血浆中稳定至少24个月。需在接近24个月时增加时间点（如30个月）进一步确认。
- 处理后样品稳定性： 经蛋白沉淀处理后的上清液，在4°C自动进样器中稳定至少48小时。
结论：
血浆稳定性实验是生物分析质量控制的基石。通过严谨的实验设计、规范的执行和合理的统计分析，能够准确评估目标分析物在各种预期条件下的稳定性特征，为样本采集、处理、储存和分析全过程提供科学可靠的操作依据和数据支持，最终确保研究结果的准确、可靠和合规。进行此类实验必须严格遵守相关规范要求，并完整记录和报告实验结果。
核心参考文献：
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM). Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry. May 2018.
- European Medicines Agency (EMA). Guideline on bioanalytical method validation. 21 July 2011. EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Rev. 1 Corr. 2*.
- International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). ICH Harmonised Guideline: Bioanalytical Method Validation and Study Sample Analysis M10. Draft version, Step 2b, July 2022. (Note: This is the latest significant development aiming to globally harmonize requirements).