外泌体miRNA测序

发布时间：2025-06-03 18:09:11 阅读量：9 作者：生物检测中心

外泌体 miRNA 测序：核心检测项目详解

外泌体携带的 microRNA (miRNA) 作为细胞间通讯的关键介质，在疾病诊断、预后评估和治疗反应监测中展现出巨大潜力。外泌体 miRNA 测序技术为解析这些微小调控分子的表达谱提供了强大工具。本文将详细阐述外泌体 miRNA 测序的核心检测项目及其技术要点。

一、 核心检测项目流程

外泌体 miRNA 测序是一个系统工程，核心检测项目可细分为以下关键阶段：

  1. 样本采集与预处理：

    • 样本类型： 血清、血浆、尿液、脑脊液、细胞培养上清液、组织液等。
    • 关键点：
      • 标准化采集： 严格统一采血管类型（如 EDTA 或 Streck 管用于血液）、采血时间、处理流程（如离心速度、时间、温度），最大限度减少前分析变异。
      • 避免污染/溶血： 血液样本需轻柔处理，避免剧烈震荡导致血小板或红细胞裂解释放 miRNA 污染外泌体组分。
      • 及时处理与保存： 样本采集后尽快低温离心分离血浆/血清（推荐 4°C, 2000-3000g, 10-20 分钟），分装后立即冻存于 -80°C。避免反复冻融。

  2. 外泌体分离与富集：

    • 核心目标： 从复杂生物体液中高效、高纯度地分离外泌体，去除杂质（如蛋白质聚集体、脂蛋白、凋亡小体等）。
    • 常用方法：
      • 差速离心 (Differential Ultracentrifugation, DUC)： 经典方法，通过梯度离心步骤分离不同大小囊泡。需严格控制离心力、时间、温度。操作繁琐，回收率可能较低，易受共沉淀物影响。
      • 密度梯度离心： 结合 DUC 使用，通过蔗糖或碘克沙醇梯度进一步纯化外泌体，提高纯度，但更耗时且样本量需求大。
      • 尺寸排阻色谱法 (Size Exclusion Chromatography, SEC)： 基于大小分离，温和高效，能较好保持外泌体完整性，回收率较高，杂质去除效果好（尤其脂蛋白），正逐渐成为主流方法。
      • 聚合物沉淀法： 操作简便快速，适合高通量或临床，但纯度较低（易共沉淀杂质），可能影响下游 RNA 提取效率或引入聚合物干扰。
      • 免疫亲和捕获法： 利用外泌体表面特异性标志物（如 CD63, CD81, CD9）的抗体进行富集，可获得特定来源或高纯度外泌体，但成本高，通量低，可能遗漏不表达特定标志物的外泌体亚群。
    • 检测项目关键点： 方法选择需平衡纯度、回收率、通量、成本和样本量。强烈推荐进行外泌体表征以确认分离效果。

  3. 外泌体表征与质量评估 (QC1)：

    • 核心目标： 确认分离物是外泌体，评估其浓度、大小分布、纯度及完整性。
    • 关键检测项目：
      • 纳米颗粒追踪分析 (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)： 核心项目。 测量外泌体颗粒浓度 (particles/mL) 和粒径分布 (典型峰值在 80-150 nm)。仪器如 Malvern NanoSight, Particle Metrix ZetaView。
      • 动态光散射 (Dynamic Light Scattering, DLS)： 测量平均粒径和分布宽度。
      • 可调电阻脉冲传感 (Tunable Resistive Pulse Sensing, TRPS)： 如 qNano/Izon，提供单颗粒粒径和浓度信息。
      • 透射电子显微镜 (Transmission Electron Microscopy, TEM)： 金标准形态学验证。 观察外泌体典型的“杯状”或“双凹圆盘”形态（注意制样可能引起变形）。需负染色。
      • 外泌体标志物检测 (Western Blot/Flow Cytometry)： 核心项目。 检测阳性标志物（如跨膜蛋白 CD63, CD81, CD9, TSG101, Alix）和阴性标志物（如内质网蛋白 Calnexin, 线粒体蛋白 Cytochrome C）以评估纯度。
      • 蛋白质浓度测定： 辅助评估纯度（通常要求与外泌体颗粒数比例合理，过高提示杂质多）。

  4. 外泌体 RNA 提取：

    • 核心目标： 从少量外泌体中高效、完整地提取总 RNA（主要成分为小 RNA，包括 miRNA）。
    • 关键点：
      • 方法选择： 专用商业化试剂盒（如 Qiagen exoRNeasy, Norgen, Invitrogen Total Exosome RNA Kit）效果通常优于通用 TRIzol 法，尤其对小 RNA 富集和去除抑制物更优。
      • 去除共沉淀污染物： 特别注意去除分离步骤中可能共沉淀的蛋白质或聚合物（如沉淀法）。
      • gDNA 去除： 推荐使用 DNase I 处理以消除基因组 DNA 污染。
      • 质量控制 (QC2)： 核心项目。
        • 浓度与纯度： 微量分光光度计（如 NanoDrop）检测 RNA 浓度 (ng/μL) 和 OD260/280 (>1.8), OD260/230 (>1.8) 比值评估纯度（注意微量样本误差较大）。
        • 完整性： 关键！ 使用高灵敏度生物分析仪（如 Agilent Bioanalyzer 2100 配合 Small RNA Kit 或 RNA 6000 Pico Kit）检测 RNA 完整性。外泌体 RNA 高度降解是正常的，但应可见清晰的 miRNA peak (~22 nt) 和 tRNA/rRNA 降解峰。RIN (RNA Integrity Number) 通常很低 (<4)，关注小 RNA 区域质量。荧光染料法（如 Qubit microRNA Assay）可更准确定量 miRNA。
        • miRNA 代表性： RT-qPCR 检测管家 miRNA (如 miR-16, miR-26a, miR-93) 或已知高丰度外泌体 miRNA，确认 miRNA 被有效提取。

  5. 小 RNA 文库构建：

    • 核心目标： 将提取的总 RNA 中的小 RNA（主要是 miRNA）转化为适用于高通量测序的 DNA 文库。
    • 关键步骤与检测项目：
      • 接头连接： 在 RNA 分子的 3' 端和 5' 端连接特异性测序接头。需避免接头二聚体形成。
      • 反转录： 将连接了接头的 RNA 反转录成 cDNA。
      • cDNA 扩增： 使用带索引（Barcode/Index）的引物进行 PCR 扩增，引入样本特异性标签以实现多重测序（Multiplexing）。
      • 文库片段大小选择： 核心项目。 通过凝胶电泳或磁珠（如 AMPure XP Beads）精确选择目标大小的文库片段（通常集中在 140-160 bp，对应插入的 miRNA 片段）。此步骤对去除接头二聚体（~120 bp）和未连接产物、大片段污染至关重要。
      • 文库质量控制 (QC3)： 核心项目。
        • 浓度： Qubit dsDNA HS Assay 定量。
        • 片段大小分布： Agilent Bioanalyzer 2100 或 Fragment Analyzer 使用 High Sensitivity DNA Kit 检测，确认主峰在预期范围且无杂峰。
        • 文库摩尔浓度： 结合浓度和片段大小分布计算 (nM)，用于精确混合不同样本进行上机测序。

  6. 高通量测序：

    • 平台选择： Illumina (NextSeq, NovaSeq, MiSeq) 是绝对主流，因其通量高、成本相对低、准确性好。华大基因 DNBSEQ 平台也是选择。
    • 核心检测项目：
      • 测序策略： 单端测序 (Single-end, SE)。 miRNA 长度短，单端 50-75 bp 足以覆盖。
      • 测序深度： 核心考量。 取决于研究目的（发现 vs 验证）、样本复杂度、预期低丰度目标。一般推荐 5-20 million clean reads per sample。探索性研究或样本异质性高时宜更深。
      • 上机与运行监控： 监控测序仪运行状态（簇密度、质量分数分布、错误率、Phasing/Prephasing 等）。

  7. 生物信息学分析：

    • 核心目标： 将原始测序数据转化为生物学洞见。
    • 关键检测分析项目：
      • 原始数据质控 (QC4)： 核心项目。 使用 FastQC 等工具评估原始 reads 质量（Phred 分数分布）、接头污染、GC 含量、长度分布、重复率等。MultiQC 汇总多个样本结果。
      • 数据预处理：
        • 去接头与低质量修剪： 使用 Cutadapt, Trimmomatic 等工具去除测序接头序列和低质量碱基。
        • 去重复： 可选但需谨慎（UMI 可有效去 PCR 重复，普通文库去重复可能损失真实生物学重复信号）。
      • 比对与定量：
        • 参考序列： 人类基因组 (hg38/GRCh38) 和小 RNA 数据库（如 miRBase - 核心参考数据库）。
        • 比对工具： Bowtie, STAR, BWA 等，需设置允许少量错配（如 -v 1）。
        • 定量： 计算每个样本中每个已知 miRNA 的原始 counts 或标准化后的表达量（如 RPM/CPM, RPKM/FPKM 对 miRNA 不常用，推荐使用 TMM, DESeq2 等标准化方法）。
      • 新 miRNA 预测： 使用 miRDeep2, miRDeep* 等工具预测未被 miRBase 收录的新 miRNA 候选分子。
      • 差异表达分析 (Differential Expression Analysis, DEA)： 核心项目。 使用 DESeq2, edgeR, limma-voom 等工具鉴定不同组别（如疾病 vs 对照）间显著差异表达的 miRNA (DEmiRNA)。设置合理的显著性阈值（如 p-adj < 0.05 和 |log2FC| > 1）。
      • 靶基因预测与功能富集分析： 核心项目。
        • 靶基因预测： 使用 miRDB, TargetScan, miRanda 等工具预测 DEmiRNA 的靶基因。
        • 功能富集： 对靶基因进行 GO (Gene Ontology) 功能注释富集分析和 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 通路富集分析（工具如 DAVID, Metascape, clusterProfiler），揭示 DEmiRNA 参与的生物学过程和通路。
      • 聚类分析： 如层次聚类、PCA (主成分分析)，评估样本间关系及组别分离情况。
      • 诊断/预后模型构建： 利用机器学习（如 SVM, Random Forest）筛选 miRNA 特征组合，评估其诊断或预后价值（ROC 曲线分析，AUC 值）。

二、 贯穿全程的质量控制 (QC)

质量控制是外泌体 miRNA 测序成功的关键，必须贯穿每个步骤：

  • 样本 QC： 记录样本状态（溶血、脂血等）。
  • 外泌体分离 QC (QC1)： NTA 浓度/粒径，WB/流式标志物检测。
  • RNA 提取 QC (QC2)： Bioanalyzer 小 RNA 峰图，Qubit 定量，管家 miRNA qPCR。
  • 文库 QC (QC3)： Bioanalyzer/Fragment Analyzer 大小分布，Qubit 浓度。
  • 原始数据 QC (QC4)： FastQC/MultiQC 报告。
  • 分析 QC： 比对率、miRNA 占比、文库复杂度、批次效应评估（如 PCA 图中样本按批次而非组别聚类）。

三、 重要注意事项

  • 批次效应： 合理安排实验批次，使用随机化和重复样本。分析时校正批次效应。
  • 标准化方法： 选择适合 miRNA 测序数据的标准化方法至关重要。
  • 验证： 重要发现需通过独立方法（如 RT-qPCR）在独立队列中验证。
  • 数据库版本： 明确记录 miRBase 等数据库版本号，因 miRNA 注释会更新。
  • 数据存储与共享： 原始数据通常上传至公共数据库（如 GEO, SRA）。

结论：

外泌体 miRNA 测序是一个复杂但强大的技术。其核心检测项目涵盖了从样本前处理到生物信息学分析的完整链条，每个环节的严谨操作和严格质控是获得可靠、可重复结果的基础。深入理解并优化这些检测项目，对于挖掘外泌体 miRNA 在疾病机制研究和转化医学应用中的价值至关重要。随着技术的不断进步（如单外泌体分析、长读长测序），该领域的研究深度和广度将持续拓展。