代谢产物鉴定实验

代谢产物鉴定实验方案

代谢产物鉴定是阐明生物系统生理状态、疾病机制、药物作用及环境响应的关键环节。本方案详细描述了基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）技术的完整代谢产物鉴定流程，适用于血浆、尿液、组织、细胞等多种生物样本。

一、 实验目的

• 全面、准确地鉴定生物样本中的内源性及外源性小分子代谢产物（分子量通常<1500 Da）。
• 为代谢组学、药物代谢、毒理学、营养学等研究提供分子层面的数据支持。

二、 实验原理 利用液相色谱（LC）的高效分离能力，结合高分辨质谱（HRMS）提供的高精确质量数（通常精度<5 ppm）和高分辨率（通常分辨率>30000 FWHM），获取代谢物的保留时间（RT）和精确分子量（质荷比 m/z）。通过碰撞诱导解离（CID或HCD）等方式获取代谢物的二级质谱（MS/MS）碎片信息。综合RT、精确分子量、MS/MS碎片离子以及同位素分布模式等信息，结合代谢物数据库、标准品比对及专业软件分析，实现对代谢物的结构鉴定。

三、 实验材料与仪器

• 生物样本： 采集后的血浆、血清、尿液、组织匀浆液、细胞提取液等（需按规范预处理后于-80°C保存）。
• 溶剂与试剂：
  • 甲醇、乙腈（LC-MS级）。
  • 甲酸、甲酸铵（LC-MS级）。
  • 超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）。
  • 溶剂配制：流动相A相：超纯水 + 0.1%甲酸；流动相B相：乙腈 + 0.1%甲酸（或其他优化配方）。萃取溶剂（如甲醇/乙腈/水混合液）。
• 主要仪器设备：
  • 液相色谱系统： 超高效液相色谱系统（UHPLC），配备恒温自动进样器及色谱柱（常用反相C18色谱柱）。
  • 高分辨质谱仪： 四极杆-静电场轨道阱质谱仪（Q-Exactive系列等）或四极杆-飞行时间质谱仪（Q-TOF系列等）。
  • 样品前处理设备： 冷冻高速离心机、真空离心浓缩仪、涡旋混合器、超声波破碎仪、组织研磨仪（如使用研磨珠）。
  • 数据分析软件： 质谱仪器配套的数据采集与处理软件，专业代谢组学/代谢物鉴定软件（用于峰提取、峰对齐、数据库检索、统计分析等）。

四、 实验步骤

1. 样本前处理：

   • 解冻与分装： 样本于冰上解冻，充分混匀后取适量用于提取（避免反复冻融）。
   • 蛋白沉淀（针对含蛋白样本）：
     • 取一定体积样本（如50 μL血浆/血清）。
     • 加入4倍体积预冷沉淀溶剂（如含内标的甲醇或乙腈/甲醇混合物）。
     • 涡旋混合1-3分钟。
     • 低温（4°C或-20°C）静置放置10-30分钟。
     • 高速离心（如13000-15000 g，4°C，15分钟）。
     • 小心吸取上清液，转移至新管。
   • 萃取（尿液/细胞/组织）： 根据代谢物性质选择合适方法（液液萃取、固相萃取）。常用方法：样本与有机溶剂（如甲醇/乙腈/水混合物）按比例混合，涡旋，超声，离心取上清。
   • 浓缩复溶： 若上清液中有机溶剂比例过高或浓度过低，可用真空离心浓缩仪适当浓缩，再用起始流动相（如A相）复溶。
   • 离心过滤： 进样前，样本溶液需经微孔滤膜（如0.22 μm）过滤或再次高速离心，去除微小颗粒杂质。
   • 质量控制（QC）样本制备： 取所有待测样本等量混合，制备QC样本，用于监控整个分析过程的稳定性和重现性。

2. 液相色谱-质谱（LC-HRMS/MS）分析：

   • 色谱条件：
     • 色谱柱： 反相C18色谱柱（如1.7-1.8 μm粒径，2.1 x 100 mm）。
     • 柱温： 40-50°C。
     • 流速： 0.3-0.4 mL/min。
     • 进样量： 1-10 μL（根据浓度优化）。
     • 梯度洗脱程序： 优化设计，常用梯度从高水相（如95-98% A）开始，逐步增加有机相（B）比例至95-98%，再平衡至初始条件。总运行时间通常为10-25分钟。
   • 质谱条件：
     • 离子源： 电喷雾离子源（ESI），正离子模式（ESI+）和/或负离子模式（ESI-）下分别采集数据。
     • 源参数： 优化雾化气、加热气温度及流速、毛细管电压、离子传输管温度等。
     • 全扫描（Full Scan/MS1）：
       • 扫描范围：例如 m/z 70-1050。
       • 分辨率：≥35000 FWHM (@ m/z 200)。
       • AGC目标值：3e6。
       • 最大注入时间（MIT）：100 ms。
     • 数据依赖性质谱采集（DDA）：
       • 选择Top N（如Top 10）强度最高的母离子进行碎裂。
       • 碎裂模式：HCD或CID。
       • 归一化碰撞能量（NCE）：根据化合物类型优化（如20， 30， 40 eV阶梯能量或固定值）。
       • MS/MS分辨率：≥17500 FWHM。
       • AGC目标值：1e5。
       • MIT：50 ms。
       • 动态排除时间：12-30秒。
     • 数据非依赖性质谱采集（DIA）： (可选，用于更全面的碎片信息获取)
       • 将整个扫描范围划分为多个隔离窗口（如25 Da宽）。
       • 依次对每个窗口内的所有母离子进行碎裂采集。
       • 设置合适的碎裂能量。
       • MS/MS分辨率：≥17500 FWHM。

3. 数据采集序列：

   • 分析前先用QC样本平衡系统至稳定。
   • 样本顺序应采用随机化或交叉排列，避免批次效应。
   • 每分析一定数量（如5-10个）样本后穿插一个QC样本，全程监控。
   • 必要时运行空白样本（溶剂空白）。

五、 数据处理与代谢物鉴定

1. 原始数据预处理：

   • 使用专业软件进行峰提取、峰对齐、峰积分。
   • 去除背景噪音、溶剂峰等。
   • 进行数据归一化（如基于总离子流TIC、内标、QC样品等）。

2. 代谢物初步鉴定（Level 2 Identification - Tentative Candidates）：

   • 精确质量匹配（Level 1 Identification - 仅限同分异构体区分不开的情况）：
     • 根据MS1得到的精确分子量（m/z），计算可能的分子式（元素组成）。
     • 在专业代谢物数据库中进行精确质量检索（容许偏差通常设定为±5 ppm或更严）。
   • MS/MS碎片匹配（Level 2 Identification - 核心步骤）：
     • 将实验获得的MS/MS谱图与数据库中的标准谱图进行匹配（常用数据库：METLIN, MassBank, mzCloud, HMDB, LipidMaps等）。
     • 关键参数：匹配得分（如mzCloud的FT Similarity Score）、主要碎片离子是否匹配、碎片离子强度模式相似度。
     • 综合MS1精确质量和MS/MS匹配结果，给出可能的候选代谢物结构列表（通常是几个同分异构体）。

3. 代谢物确证（Level 1 Identification - Confident Identification）：

   • 标准品比对验证：
     • 在相同实验条件下分析目标代谢物的化学标准品。
     • 对比保留时间：目标峰RT与标准品RT需一致（容许偏差通常<0.1-0.2 min）。
     • 对比MS1精确质量：一致（偏差在设定阈值内）。
     • 对比MS/MS谱图： 这是最强有力的确证证据（Level 1）。实验谱图与标准品谱图需高度匹配（主要碎片离子及相对丰度一致）。这是鉴定“金标准”。
   • 其他支持证据：
     • 同位素丰度模式匹配： 实验谱图的同位素峰分布（如[M+1], [M+2]）与理论计算值吻合。
     • 色谱峰形状： 无异常拖尾或分叉。

4. 未知代谢物结构解析：

   • 对于无法匹配数据库的未知峰或新代谢物：
     • 深入分析MS/MS碎片离子：推断可能的裂解途径（如失去H2O, CO2, 特征基团丢失），生成特征碎片离子。
     • 利用软件预测可能的裂解（如CFM-ID）。
     • 结合可能的分子式、生物学背景知识（来源、已知通路）进行推断。
     • 最终确证需要合成或分离纯化后通过核磁共振（NMR）等正交技术进行结构鉴定（Level 1）。

六、 结果报告与质量控制

1. 报告内容：

   • 清晰列出所有鉴定到的代谢物列表（已确证Level 1和暂定Level 2需明确标注）。
   • 每个代谢物提供的信息：代谢物名称、数据库ID（如HMDB00001）、分子式、实测精确分子量（m/z）、保留时间（RT）、检测模式（ESI+/ESI-）、鉴定置信度级别、对应的MS/MS谱图（或关键碎片离子）。
   • 详细记录鉴定依据（特别是标准品比对信息）。
   • 数据预处理和统计分析方法说明。
   • 相关的QC数据（如TIC叠加图、主成分分析图显示QC样本聚集良好）。

2. 质量控制（QC）：

   • 系统适用性： 分析前用标准品混合物测试系统灵敏度和稳定性。
   • 过程监控： QC样本的保留时间重现性（RSD% < 2%）、峰强度重现性（多数特征峰RSD% < 20-30%）、总离子流稳定性。
   • 空白对照： 确保无明显污染。
   • 数据质量： 评估色谱峰形、信噪比、MS/MS谱图质量。

七、 注意事项

1. 样本质量： 样本采集、处理、储存必须规范，避免降解和污染。快速低温处理是关键。
2. 前处理优化： 根据目标代谢物极性和稳定性选择最适提取方法，保证回收率和重现性。
3. 色谱柱平衡： 梯度运行前后需充分平衡色谱柱至初始条件。
4. 离子源污染： 定期清洗离子源和离子传输部件。
5. 数据库选择与局限性： 了解所用数据库的覆盖范围和谱图质量，不同数据库结果可能存在差异。数据库检索结果需谨慎解读。
6. 鉴定置信度分级： 严格遵循代谢组学标准倡议（MSI）定义的置信度级别（Level 1-4）。避免过度解读匹配结果。
7. 未知物标注： 清晰标注未知峰及其获得的特征信息（分子量、碎片）。
8. 数据备份： 妥善保存原始数据和处理结果。

八、 预期结果 本实验预期能够从复杂生物样本中检测并鉴定出数百至数千种代谢产物，获得它们的相对丰度信息（半定量或相对定量）。结合生物样本分组信息，可进一步进行差异代谢物筛选、代谢通路富集分析等深入生物学解释，揭示与特定生理、病理状态或干预措施相关的关键代谢变化。

本方案提供了一个通用的、基于LC-HRMS技术的代谢产物鉴定实验框架。实际研究中需根据具体样本类型、目标代谢物性质及科学问题进行针对性的优化和调整。核心在于严谨的实验设计、规范的操作流程、严格的质控以及对鉴定结果置信度的准确评估。