全血分布实验：揭示药物在血液中的归宿
全血分布实验是临床前药代动力学研究中的一项关键体外实验，主要用于定量测定药物或其代谢产物在全血与血浆之间的分配情况，并进一步计算药物与血液有形成分（主要是红细胞）的结合程度。其结果对于理解药物的体内分布、清除机制以及预测其药效学和毒理学行为至关重要。
一、 实验目的与意义
- 药物在血液中的分布状态： 确定药物是倾向于分布在血浆中，还是更易与血细胞（尤其是红细胞）结合。这直接影响药物在循环系统中的可及性。
- 计算血细胞结合率： 定量评估药物与红细胞等血液有形成分的结合程度（通常表示为血细胞结合率）。
- 关联血浆蛋白结合率： 全血分布数据常与血浆蛋白结合率结合分析，共同描绘药物在血液中的整体结合特征。理解药物在血浆（蛋白结合）和血细胞中的分布比例，对于解释体内药代动力学行为（如分布容积、清除率）至关重要。
- 预测体内分布： 药物的血细胞结合特性会影响其在组织器官中的分布模式和程度，特别是富含血管的组织或器官。
- 物种差异评估： 比较药物在不同实验动物（如大鼠、犬、猴）及人全血中的分布差异，有助于评估临床前数据的可外推性及选择更合适的毒理学种属。
- 支持药代动力学/药效学建模： 为建立更准确的生理药代动力学模型提供关键输入参数。
二、 实验原理
全血分布实验的核心原理是基于药物在全血和血浆（或缓冲液）两相之间达到分配平衡。
- 孵育： 将已知浓度的待测药物加入新鲜采集的抗凝全血（通常来源于相关实验动物或人）中。混合均匀后，在恒温（通常37°C）条件下孵育一段时间，确保药物在全血各组分中达到分配平衡。
- 分离： 孵育结束后，立即将样品在适当条件下（通常为4°C或室温离心）进行离心分离，得到血浆和血细胞团块（主要是浓缩的红细胞）。
- 测定：
- 准确测量分离出的血浆体积。
- 准确测定血浆中的药物浓度 (
C_plasma)。 - 通常还需准确测定全血中剩余部分的药物浓度 (
C_blood_remaining) 或通过质量平衡法计算血细胞部分的药物含量。 - 实验中通常设置缓冲液组进行平行孵育，以区分真实结合与仪器/材料的非特异性吸附。
- 计算关键参数：
- 血液-血浆浓度比值：
Kp_b/p = C_blood / C_plasma其中，C_blood是全血中的药物浓度（由测得血浆浓度和红细胞容积推算，或直接测定全血剩余部分浓度）。Kp_b/p ≈ 1： 表明药物均匀分布于全血各组分，或主要存在于血浆水相，不与血浆蛋白或血细胞显著结合。Kp_b/p > 1： 表明药物倾向于结合到血细胞（通常是红细胞）上。Kp_b/p < 1： 表明药物主要存在于血浆相，可能与血浆蛋白高度结合，而较少进入或结合血细胞。
- 血细胞结合率： 反映药物与红细胞等血细胞结合的百分比。
Blood Cell Binding (%) = [1 - (C_plasma * (1 - Hct) / C_blood)] * 100%其中Hct是血细胞比容（离心后血细胞体积占全血体积的百分比）。- 该值越高，表明药物结合在血细胞上的比例越大。
- 血液-血浆浓度比值：
三、 实验材料与方法概述
- 全血来源： 新鲜采集自健康实验动物（大鼠、小鼠、犬、猴等）或人（如健康志愿者血），并用合适的抗凝剂（如肝素钠、EDTA）处理。保持新鲜度至关重要，通常建议在采集后短时间内使用。
- 药物储备液： 溶解于生物相容性溶剂（如DMSO、乙醇、生理盐水），注意溶剂终浓度不影响实验结果（通常 ≤1% v/v）。
- 孵育： 将药物加入全血中，混合均匀。在37°C恒温水浴或培养箱中孵育（通常数十分钟至数小时），期间轻柔摇动以保证混合均匀和维持氧气水平。孵育时间需通过预实验确定，确保达到分配平衡。
- 分离：
- 孵育结束后，立即将样品转移到离心管中。
- 在预定温度（常为4°C或室温）和离心力（如约2000-3000 g）下离心一段时间（如10-15分钟），使血细胞与血浆清晰分离。
- 小心吸取上层血浆，尽量避免扰动下层血细胞团块。
- 精确测量所得血浆的体积。
- 样品处理与分析：
- 血浆样品： 通常可直接或适当稀释后用灵敏的分析方法（如LC-MS/MS）测定药物浓度 (
C_plasma)。 - 全血样品残留部分： 准确称重或测量体积，加入适当比例的溶剂（如乙腈/水混合液、缓冲液）进行萃取，离心后取上清液分析测定药物浓度 (
C_blood_remaining)，用以计算C_blood。 - 质量控制：
- 平衡验证： 设置不同孵育时间点，确认药物浓度在选定时间内达到稳定。
- 非特异性结合： 设置含药物的缓冲液样本，在相同实验容器中孵育、离心，测定离心管壁和/或分离装置上的药物吸附量，用于校正
C_plasma和C_blood。 - 稳定性： 考察药物在全血和血浆于实验条件下的稳定性（37°C孵育期间）。
- 基质效应： 评估生物基质对分析方法的影响。
- 血细胞比容测定： 使用毛细管法或血液分析仪准确测定每个血样（或同批次血样）的Hct值。
- 血浆样品： 通常可直接或适当稀释后用灵敏的分析方法（如LC-MS/MS）测定药物浓度 (
- 数据处理： 利用上述公式计算
Kp_b/p和血细胞结合率。数据通常以平均值±标准差表示。
四、 关键影响因素与注意事项
- 全血质量： 血液的新鲜度、抗凝剂种类、储存条件和时间显著影响红细胞的完整性和功能，从而影响结果。应使用新鲜血液并尽快实验。
- 药物理化性质： 亲脂性强的药物更易与细胞膜结合（导致
Kp_b/p >1）；能与血红蛋白或红细胞膜上特定蛋白/转运体相互作用的药物也会表现出高血细胞结合。 - 浓度依赖性： 对于与血细胞结合位点亲和力有限的药物，在高浓度下可能出现结合饱和现象（非线性），因此建议在预期治疗（或毒理）浓度范围内考察浓度依赖性。
- 孵育条件： 温度（严格37°C）、孵育时间（确保平衡）、混合方式（避免溶血）必须严格控制。
- 分离条件： 离心温度、时间和速度需标准化，确保血浆与血细胞有效分离且无明显溶血（溶血会混淆血浆和血细胞含量）。
- 分析方法： 需要灵敏度高、特异性强的分析方法准确测定血浆和全血残留物中的药物浓度。
- 非特异性结合校正： 实验器材（离心管、移液枪头）对药物的吸附是常见误差来源，必须通过对照组进行量化并校正。
五、 结果解读与应用
- 高血细胞结合 (
Kp_b/p >1, 高血细胞结合率)：- 药物在循环中主要存在于血细胞内。
- 可能影响其向组织器官的分布速率和程度。
- 可能影响基于血浆浓度的PK参数计算（如分布容积Vd）。
- 若结合可饱和，在高剂量下可能导致游离药物比例非线性升高，增加毒性风险。
- 可能成为药物的储存库，延长其体内停留时间。
- 与红细胞结合可能导致血液学相关的毒性。
- 低血细胞结合 / 主要分布于血浆 (
Kp_b/p <1, 低血细胞结合率)：- 药物主要存在于血浆中。
- 其分布行为主要受血浆蛋白结合率驱动（需结合血浆蛋白结合实验结果分析）。
- 向组织的分布主要取决于穿过毛细血管的能力以及与组织成分的结合。
- 种属差异： 同一药物在不同种属全血中的分布可能存在显著差异（源于红细胞膜结构、血红蛋白类型、膜转运体表达等的不同）。这种差异对于理解动物实验结果外推至人的可靠性至关重要。
- 指导后续研究：
- 解释体内药代动力学数据（如Vd）。
- 预测药物在特定组织（如血流量大的器官）的暴露量。
- 评估药物相互作用（如影响红细胞功能的药物）。
- 为生理药代动力学建模提供关键参数。
- 支持首次人体试验的剂量设计。
六、 局限性
- 体外局限性： 体外孵育环境无法完全模拟体内复杂的血液流动、代谢和排泄过程。
- 动态平衡： 体内药物在血浆和血细胞间的分布是动态过程，体外测定的平衡常数只能部分反映体内情况。
- 代谢影响： 如果药物在孵育期间被血细胞或血浆酶显著代谢，会影响浓度测定结果的准确性。
- 红细胞完整性： 实验操作必须非常小心，避免溶血，否则会严重干扰结果。
结论
全血分布实验是评估药物体内分布特征不可或缺的体外工具。通过精确测定药物在全血与血浆之间的分配系数和血细胞结合率，该实验为理解药物的药代动力学行为、预测其组织分布特征、评估种属差异以及支持后续的药物开发决策提供了关键信息。严谨的实验设计、规范的操作流程、灵敏可靠的分析方法以及对结果影响因素的充分考量，是获取可靠、可解读的全血分布数据的基础。这些数据对于将临床前发现成功转化到临床应用具有重要意义。