急性毒性试验（MTD）

急性毒性试验与最大耐受剂量（MTD）概述

急性毒性试验是药物非临床安全性评价的起点，旨在短期内（通常单次或24小时内多次给药）评估受试物对生物机体产生的毒性作用，其核心目标之一是确定最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose, MTD）。

一、 急性毒性试验的目的

1. 初步揭示毒性反应性质与靶器官： 观察给药后动物出现的临床症状、病理学改变，初步判断毒性作用的靶器官和组织。
2. 确定剂量反应关系与致死剂量范围： 了解毒性反应或死亡的发生率与剂量间的关联，估算致死剂量参数（如近似致死剂量 ALD，半数致死剂量 LD50 - 尽管现在更强调观察症状而非精确计算LD50）。
3. 确定最大耐受剂量（MTD）： 这是急性毒性试验最关键的目的之一。
4. 为后续研究提供剂量设计依据： 为长期毒性试验、遗传毒性试验、生殖毒性试验等提供关键的起始剂量和剂量范围参考。
5. 探索可能的解毒或救治方法（初步）： 有时可观察到毒性反应的时间进程，为后续临床可能需要的救治提供线索。

二、 核心概念：最大耐受剂量 (MTD)

1. 定义：

   • MTD 是指在设定的暴露条件下（如给药途径、给药速度、观察期限），受试物不会引起动物出现致命性毒性反应，也不产生严重降低其生活质量的不可逆性病理损伤的最高剂量。
   • 简单说，MTD 是动物能够“耐受”而不出现危及生命或严重健康损害的最高剂量。在这个剂量下，动物可能出现明显的毒性反应（如体重显著下降、特定的临床体征），但这些反应不应导致死亡或不可逆的器官功能衰竭，并且在停止给药后应是可逆的或动物能够存活至试验结束。

2. MTD 的意义：

   • 后续试验的“天花板”剂量： MTD 通常是长期毒性试验（如28天、90天重复给药毒性试验）最高剂量的重要上限参考。后续试验的最高剂量通常设定为等于或略低于急性毒性试验确定的 MTD。
   • 评估安全范围： MTD 与预期临床有效剂量之间的比值（安全系数）是评估药物初步安全性的重要指标。较大的比值通常意味着更宽的安全窗口。
   • 反映受试物的急性毒性潜力： MTD 值的高低直接反映了受试物急性毒性的强弱。MTD 越低，表明物质的急性毒性越强。

三、 急性毒性试验的设计要点

1. 受试物： 应使用工艺和组成稳定、质量可控的批次。
2. 实验动物：
   • 种属： 通常选用两种哺乳动物，其中一种为啮齿类（常用大鼠、小鼠），另一种为非啮齿类（常用比格犬、小型猪或猴）。啮齿类动物成本较低，数量需求较多；非啮齿类动物在生理和解剖上更接近人，但成本高、用量少。
   • 性别： 通常要求使用两种性别（除非有特定理由只用一种）。
   • 年龄/体重： 使用年轻、健康的成年动物。啮齿类起始体重差异应在一定范围内。
   • 数量： 啮齿类通常每组各性别 ≥ 5 只；非啮齿类通常每组各性别 ≥ 2 只（如犬）。
   • 饲养与环境： 符合GLP规范和动物福利要求（如SPF级环境、标准饲料、自由饮水、合适温湿度光照周期）。
3. 给药途径：
   • 应尽可能与临床拟用途径一致（如口服、静脉注射、皮下注射、腹腔注射、吸入、皮肤涂抹等）。
   • 有时会增加一种注射途径（如腹腔注射）以评估吸收后的全身毒性。
4. 剂量设计与分组：
   • 这是试验成功的关键环节。
   • 通常设置3个或以上的剂量组和一个溶媒对照组。
   • 剂量范围应足够宽，以期涵盖从无明显观察到出现严重毒性（包括死亡）的范围。
   • 初始剂量的选择可参考文献、结构类似物数据、或通过预试验（剂量范围探索试验）确定。
   • 剂量组距通常按几何级数递增（如2倍、3.16倍 √10、4倍）。
5. 给药方案：
   • 通常为单次给药。
   • 对于毒性可能延迟出现的物质，或特定给药途径（如某些吸入剂），可能采用24小时内多次给药。
   • 严格控制给药体积和速度。
6. 观察期：
   • 给药后即刻密切观察： 重点关注给药后4小时内的急性反应。
   • 系统观察期： 至少持续 14天。记录所有动物的死亡情况、毒性症状出现和消失的时间、严重程度。
   • 对濒死或死亡动物应及时解剖；存活动物在观察期结束时安乐死并解剖。
7. 观察指标：
   • 临床观察： 每日至少两次详细观察动物外观、行为活动、精神状态、呼吸、循环、自主神经活动（如瞳孔、唾液分泌）、神经系统（如震颤、抽搐、强直、反射）、泌尿生殖系统（如会阴部污秽）等体征。记录症状发生时间、程度、持续时间、是否可逆。
   • 体重： 给药前、给药后定期测量（如第1、3、7、14天），体重变化是反映毒性的敏感指标。
   • 摄食量： 定期记录（通常与体重测量同步）。
   • 大体解剖： 所有试验结束（死亡或安乐死）的动物均应进行系统的大体解剖，观察各器官组织有无肉眼可见的病变。对主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑、性腺等）应称重并计算脏器系数（脏器重量/体重）。
   • 组织病理学检查： 通常不是急性毒性试验的常规要求。但当出现死亡、濒死、或观察到明显的器官损伤体征，或为了解释特定毒性机制时，需要对相关靶器官进行组织病理学检查。MTD的确定主要依靠临床症状和存活率。

四、 MTD 的确定

1. 依据： 主要基于给药后 14天 观察期内动物的存活情况、临床症状的严重程度和可逆性、以及体重变化等指标。
2. 标准：
   • 在设定的观察期内，该剂量组动物没有出现因药物直接相关的死亡（允许个别动物死于操作失误等非药物因素）。
   • 动物表现出明显的毒性反应（如活动减少、皮毛竖立、体重显著下降 > 10%、特定靶器官毒性症状等），但这些反应不会致命（如未导致器官衰竭）。
   • 这些毒性反应在观察结束前趋于稳定或开始恢复（部分反应可能是不可逆的，但不足以导致动物死亡或需要提前处死）。
   • 该剂量组的毒性反应显著重于下一个低剂量组（证明已达到“最大耐受”的临界点）。
3. 方法： 通过对不同剂量组动物反应的对比分析来确定。例如：
   • 剂量组A (100 mg/kg)：无明显异常 -> 未达MTD。
   • 剂量组B (300 mg/kg)：动物短暂活动减少，轻度体重下降（<10%），可恢复 -> 未达MTD（显示耐受）。
   • 剂量组C (1000 mg/kg)：动物严重嗜睡、竖毛、体重显著下降 (>15%)，但无死亡，观察后期体重开始恢复/症状减轻 -> 此剂量被确定为 MTD。
   • 剂量组D (3000 mg/kg)：动物出现死亡或濒死，伴有严重器官损伤症状（如抽搐、呼吸困难、黄疸等）-> 高于MTD。

五、 报告与结果分析

试验报告需详细描述：

• 材料与方法（动物、剂量、途径、观察等）。
• 结果：
  • 详细的临床症状列表（发生率、严重程度、时间进程）。
  • 体重变化曲线和摄食量数据。
  • 死亡情况（数量、时间）。
  • 大体解剖所见（病变描述）。
  • 脏器重量和系数（如有）。
  • 明确确定的 MTD 值及其依据（关键结论）。
  • 估算的致死剂量参数（如 LD50，如果适用且有足够数据）。
• 结论：总结主要的毒性反应、靶器官、MTD值及其对后续安全性评价的指导意义。

六、 局限性

• MTD 反映的是急性、单次/短时暴露下的最大耐受能力。
• 动物实验结果外推到人存在不确定性。
• 无法预测长期慢性毒性、特殊毒性（如致癌、致畸、免疫毒性）或延迟性毒性。
• 主要依赖临床症状观察，深入机制研究需后续试验。

结论

急性毒性试验是药物安全性评价的基石，其核心任务之一是通过严谨的设计和观察，确定最大耐受剂量（MTD）。MTD 提供了受试物急性毒性强度的关键信息，并作为后续所有非临床重复给药毒性试验设定最高剂量的重要上限参考，为评估药物潜在风险和进入临床试验的初步安全性奠定了科学基础。该试验必须在遵循良好实验室规范（GLP）和动物伦理福利原则（如 IACUC 审查、3R 原则）的前提下进行。