胚胎-胎仔发育毒性试验（生殖II段）

胚胎-胎仔发育毒性试验（生殖毒性 II 段试验）

1. 定义与目的

胚胎-胎仔发育毒性试验（Embryo-Fetal Development Toxicity Study, EFDT），是药物安全性评价中生殖毒性研究的核心组成部分（通常称为 II 段试验）。该试验旨在评估受试物在母体妊娠期暴露，特别是器官形成关键时期暴露，对胚胎和胎仔发育造成的潜在不良影响。

核心目的：

• 识别胚胎致死性： 评估受试物是否导致胚胎吸收、流产或死胎发生率增加。
• 检测致畸性： 识别受试物是否诱发胎仔结构畸形（外观、内脏、骨骼）。
• 评价胎仔生长发育影响： 评估受试物是否干扰胎仔的生长（体重、身长）、发育成熟度（骨化程度）和功能发育。
• 评估母体毒性及其关联： 观察受试物对孕鼠/兔的毒性反应（如体重变化、临床体征、死亡率），并分析母体毒性与发育毒性之间的关联性（是直接作用还是继发于母体毒性）。
• 确定未观察到不良效应水平（NOAEL）： 为风险评估和确定安全暴露水平提供关键数据。

2. 试验设计要点

• 受试动物：
  • 首选两种哺乳动物：大鼠（常用SD或Wistar品系）和兔（常用新西兰白兔）。
  • 选择理由：
    • 大鼠：生育力强、妊娠期短、产仔数多、成本低且背景数据丰富。是核心物种。
    • 兔：对某些类别化合物（如沙利度胺、某些抗生素）更敏感；其胎盘结构与人更接近（卵黄囊胎盘）；是重要的非啮齿类补充物种，尤其在评价生物制品时可能更相关。
    • 小鼠有时用作替代或补充，但非首选。
• 动物数量与分组：
  • 每组需有足够孕鼠/兔以产生可靠的统计学数据（通常大鼠每组≥16-20只孕鼠，兔每组≥16-20只孕兔）。
  • 设置至少三个剂量组和一个溶媒/赋形剂对照组。
  • 必要时增设阳性对照组（已知致畸物，如环磷酰胺、乙酰水杨酸等），用于验证试验系统的敏感性。
• 给药时期：
  • 关键窗口期： 器官形成期。
    • 大鼠： 通常为妊娠第6天至第17天（GD 6-GD 17）。大鼠主要器官形成在此阶段完成。
    • 兔： 通常为妊娠第6天至第18天（GD 6-GD 18）。兔的器官形成期稍长。
  • 此窗口期是胚胎对致畸原最敏感的时期。
• 给药途径：
  • 应尽量模拟预期的临床给药途径（如口服、静脉注射、皮下注射、吸入、皮肤给药等）。
  • 若临床有多种途径，优先选择能产生最大暴露或最敏感反应的途径。
• 剂量选择：
  • 高剂量： 目标是产生明显的母体毒性（如体重增长抑制、特定靶器官毒性、甚至少量死亡），但不能引起超过20%的母体死亡或导致流产率过高以致无法评价胎仔。通常基于前期毒性研究（如重复给药毒性、剂量范围探索试验）确定最大耐受剂量（MTD）。
  • 中间剂量： 应能产生轻微的母体毒性或处于高、低剂量之间。
  • 低剂量： 预期为无毒性剂量（NOAEL），一般选择临床预期暴露量（AUC）的若干倍（如≥10倍）。理想情况下应高于预期的人体治疗暴露水平。
  • 对照组： 给予等体积的溶媒或赋形剂。

3. 试验实施与观察

• 母体观察：
  • 每日临床观察： 至少两次（早晚），记录外观、行为、活动水平、有无分泌物、疼痛迹象等。
  • 体重： 交配前称重（分组基础），交配期间（确定GD 0），整个给药期（如GD 0, 6, 9, 12, 15, 17/18），剖杀前。计算体重增重。
  • 摄食量： 定期测量（通常每周1-2次）。
  • 详细记录： 毒性体征的发生时间、严重程度、持续时间以及死亡情况。
• 终末检查：
  • 处死时间：
    • 大鼠： 妊娠末期，GD 20 或 GD 21（自然分娩前1天）。
    • 兔： GD 28 或 GD 29（自然分娩前1天）。
  • 母体剖检：
    • 处死后迅速解剖孕鼠/兔，检查卵巢和子宫。
    • 记录：
      • 黄体数： 每个卵巢上的黄体数量（代表排卵数）。
      • 着床数： 子宫内所有着床点的总和（包括活胎、吸收胎/死胎、早期或晚期死胎）。检查子宫是否有异常（如子宫腺吸收）。
      • 着床位置： 记录左右子宫角和位置分布。
      • 子宫重量： 称取带胎子宫重量（有时用于评估）。
  • 胎仔收集与检查：
    • 小心剥离子宫，取出每个胎仔及其胎盘。
    • 胎盘： 称重并观察大体异常（颜色、形状、大小）。
    • 胎仔：
      • 生死鉴别： 通过呼吸、对刺激的反应（如夹趾）判断是否为活胎。区分活胎、晚期死胎（已形成骨架，但未存活至检查时）、早期吸收胎（仅见着床点或肉色/深色组织块）。
      • 称重： 逐一称量活胎体重。
      • 性别鉴定： 通过肛门-生殖器距离区分性别。
      • 外观畸形检查： 在良好光线下，仔细检查每个活胎全身表面有无形态结构异常（如头部畸形、眼耳异常、腭裂、四肢畸形、短尾卷尾、脐疝、水肿、出血点等）。
      • 内脏检查：
        • 方法1（Wilson切片法）： 将部分活胎（通常一半或按预设方案）固定于Bouin液或其它适宜固定液后，用徒手切片法系统检查头部（颅腔、脑室）、胸腔（心、肺）、腹腔（肝、脾、肾、胃、肠、膀胱）和盆腔脏器。
        • 方法2（改良内脏显微解剖法）： 新鲜胎仔在生理盐水中直接解剖检查内脏器官（需熟练技术）。此方法检查心脏效果较好。
      • 骨骼检查：
        • 将剩余的活胎（或固定后胎仔）进行骨骼染色。
        • 常用染色方法： 阿利新蓝（Alcian Blue）染软骨，茜素红S（Alizarin Red S）染骨质。
        • 检查内容： 颅骨（骨化中心数目及融合情况）、胸骨节（数目、融合、分叉）、肋骨（数目、形状、分叉、融合）、脊柱（椎体数目、形状、融合）、四肢骨（长骨长度、骨化程度、指/趾骨数目和形态）、骨盆等。记录骨化延迟或缺失、骨化中心增多、骨骼畸形等。

4. 数据分析与评价

• 母体数据：
  • 死亡率、临床毒性体征发生率及严重程度。
  • 体重数据（绝对体重、体重增重、校正体重增重）。
  • 摄食量。
  • 剖检结果（器官重量、大体病理）。
• 生殖数据：
  • 交配成功率（交配雌鼠中怀孕的比例）。
  • 平均黄体数/母体。
  • 平均着床数/母体（总着床数/怀孕母体数）。
  • 着床前丢失率 (%): [(黄体数 - 着床数) / 黄体数] x 100
  • 着床后丢失率 (%): [(着床数 - 活胎数) / 着床数] x 100 （反映胚胎致死性）
  • 活胎率 (%): [活胎数 / 着床数] x 100
  • 死胎率 (%): [晚期死胎数 / 着床数] x 100
  • 吸收胎率 (%): [早期吸收胎数 / 着床数] x 100
  • 平均活胎数/母体。
• 胎仔数据：
  • 活胎平均体重/性别/窝。
  • 活胎平均身长/性别/窝（可选，但推荐）。
  • 胎盘平均重量/窝。
  • 畸形发生率：
    • 外观畸形：按胎仔数和窝数统计发生率。
    • 内脏畸形：按检查胎仔数和窝数统计发生率。
    • 骨骼畸形：按检查胎仔数和窝数统计发生率。
    • 特别注意：
      • 区分畸形（永久性结构改变）、变异（种群内自然发生率较高的微小结构差异，无不良生物学意义）和发育延迟（如骨化延迟）。
      • 明确是单一畸形还是复合畸形/综合征。
      • 计算总畸形率（具有至少一种任何类型畸形的胎仔百分比）和特定畸形率。
      • 窝分析至关重要： 统计分析应以“窝”为统计单位（如评价每窝受影响胎仔的比例或有无），避免将单个胎仔视为独立样本，因为同窝胎仔数据具有相关性。常用方法包括Fisher精确检验（小样本）、类别数据分析（如广义估计方程）。
• 统计方法： 根据数据类型选用合适的统计方法（如t检验、ANOVA、Dunnett检验用于连续数据；卡方检验、Fisher精确检验、Mantel-Haenszel趋势检验用于离散数据）。
• 结果解读与结论：
  • 因果关系判定： 判断观察到的效应（胚胎致死、畸形、生长迟缓）是否由受试物引起。需考虑：
    • 剂量-反应关系（核心依据）。
    • 与对照组及历史对照数据的比较。
    • 效应的严重程度和性质（是否罕见或特异性畸形）。
    • 母体毒性存在与否及其关联（效应是否仅在母体毒性剂量下出现？）
    • 生物学合理性。
  • 风险评估： 确定母体毒性和发育毒性的NOAEL（未观察到不良效应水平）和LOAEL（最低观察到不良效应水平）。评估发育毒性风险与临床拟用剂量的安全范围。
  • 结论： 明确受试物是否具有胚胎致死性、致畸性或胎儿毒性，并确定其安全剂量范围。

5. 试验意义与应用

• 法规要求： 是药品、农药、食品添加剂、化妆品新原料（根据法规要求）等注册上市前必须提交的核心生殖毒性数据包之一（遵循ICH S5(R2/R3)、OECD 414等指南）。
• 风险管理：
  • 为临床研究人群选择提供依据（育龄期妇女是否排除？）。
  • 为药品说明书【孕妇及哺乳期妇女用药】、【药理毒理】等章节提供关键信息（如属于妊娠用药分类的哪一级别）。
  • 提示是否需要进一步的生殖发育研究（如围产期毒性试验）。
• 机制探索提示： 发现的特定畸形类型可为深入研究发育毒性机制提供线索。

6. 优势与局限性

• 优势： 直接评估器官形成期暴露对胚胎和胎仔发育的影响；是识别致畸物的标准方法；提供剂量-反应关系和NOAEL。
• 局限性：
  • 结果外推到人存在不确定性（种属差异）。
  • 主要检测结构畸形，对功能缺陷（行为、神经、生殖、免疫等）评估有限（需结合Ⅲ段试验）。
  • 通常不评价对生育力的影响（Ⅰ段试验）或子代出生后的发育影响（Ⅲ段试验）。
  • 高剂量下的母体毒性可能干扰对发育毒性的直接解读。

7. 总结

胚胎-胎仔发育毒性试验（Ⅱ段）是生殖毒性评价体系中不可或缺的环节，通过模拟妊娠关键时期（器官形成期）的暴露，系统评估受试物对胚胎存活、胎仔生长发育和结构完整性的潜在危害。其结果为评估受试物的发育毒性风险、制定风险管理措施（尤其是针对育龄人群）以及满足法规注册要求提供了不可或缺的科学依据。严谨的试验设计、规范的执行操作、细致的胎仔检查以及科学的统计分析是获得可靠结论的基础。

主要参考指南：

• ICH Harmonised Guideline S5(R2) Detection of Toxicity to Reproduction for Medicinal Products & Toxicity to Male Fertility (1993, amended 2000).
• ICH Draft Guideline S5(R3) on Reproductive Toxicology: Detection of Toxicity to Reproduction for Human Pharmaceuticals (Current Step 2 version, 2020 - 注意：最终版本可能整合至新框架ICH M3(R2)/S11)。
• OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 414: Prenatal Developmental Toxicity Study (2001).
• US FDA Redbook 2000: IV.C.9.a. Guidelines for Reproduction Studies.

请注意，具体试验方案需根据受试物特性、法规要求（国家/地区）以及最新的科学认识和指南进行调整和优化。