绝对定量转录组测序

发布时间：2025-06-03 18:00:57 阅读量：9 作者：生物检测中心

绝对定量转录组测序：精准解码基因表达的完整指南（重点：检测项目）

一、核心检测项目详解

  1. 基因/转录本绝对表达量 (Absolute Expression Level)

    • 检测内容： 精确计算每个基因或转录本在测序样本中的绝对拷贝数 (如：每细胞/每微克总RNA中的分子数)。
    • 核心价值： 无需依赖内参基因或管家基因，实现：
      • 跨样本直接比较： 不同批次、不同处理、不同个体间的表达量可精确对比。
      • 生物学意义解读： 直接反映转录本的丰度水平，更贴近分子生物学本质。
      • 定量标准建立： 为疾病诊断、药物靶点筛选提供可量化的分子基准。

  2. 差异基因表达分析 (Differentially Expressed Genes, DEGs)

    • 检测内容： 基于绝对表达量，精准识别不同处理组（如疾病vs健康、药物处理vs对照）中表达水平发生显著变化的基因/转录本。
    • 核心价值： 识别关键调控基因，揭示生物学过程、疾病机制或药物效应的核心分子驱动因素。绝对定量消除了内参波动导致的假阳性/阴性风险。

  3. 基因表达丰度分布 (Expression Abundance Distribution)

    • 检测内容： 描绘所有检测到基因的表达水平分布图谱（如高、中、低丰度基因的比例）。
    • 核心价值： 揭示转录组的整体结构特征，评估技术灵敏度（检测低丰度转录本的能力）。

  4. 新转录本/异构体发现 (Novel Isoforms/Transcripts)

    • 检测内容： 通过高深度测序和拼接组装，识别未被现有数据库注释的全新转录本或异构体。
    • 核心价值： 完善基因组注释，发现潜在功能元件或疾病相关变异体。绝对定量有助于评估新发现转录本的真实丰度。

  5. 可变剪接分析 (Alternative Splicing, AS)

    • 检测内容： 精确量化同一基因不同剪接异构体（如外显子跳跃、内含子保留等）的绝对表达比例。
    • 核心价值： 研究基因功能多样性和调控机制的关键环节，在发育、疾病（如癌症）中尤为重要。

  6. 融合基因检测 (Fusion Genes)

    • 检测内容： 识别不同基因片段异常连接形成的嵌合转录本，精确计算其绝对表达量。
    • 核心价值： 在癌症研究中至关重要，许多融合基因是强力的驱动突变和潜在治疗靶点。

  7. 等位基因特异性表达 (Allele-Specific Expression, ASE)

    • 检测内容： 在杂合子位点，精确测量来自父本和母本等位基因的转录本绝对数量。
    • 核心价值： 研究基因组印记、顺式调控元件变异（如eQTL）的重要工具。

  8. 表达定量性状位点 (Expression Quantitative Trait Loci, eQTL) 分析

    • 检测内容： 结合基因分型数据，分析基因组特定位置（位点）的遗传变异（SNP）与目标基因绝对表达量之间的关联。
    • 核心价值： 解析复杂性状和疾病易感性的遗传调控基础。

二、技术流程概要

  1. 样本制备： 高质量总RNA提取（含rRNA去除或mRNA富集）。
  2. 文库构建 (关键步骤)：
    • 引入分子标签 (UMIs)： 每个原始RNA分子在反转录前被标记唯一分子标识符，用于校正PCR扩增偏差和测序重复。
    • 全长或接近全长cDNA合成。
    • 片段化、加接头、PCR扩增。
  3. 高通量测序： Illumina等平台进行双端测序 (PE150推荐)。
  4. 生物信息学分析：
    • 原始数据质控与过滤。
    • UMI处理：纠错、去重，还原原始分子数。
    • 序列比对至参考基因组/转录组。
    • 绝对定量计算： 统计比对到每个基因/转录本上的有效UMI数，即代表该转录本的原始分子数。
    • 后续分析：差异表达、可变剪接、融合基因等（基于绝对表达量矩阵）。

三、核心优势 (与相对定量RNA-seq相比)

  • 真正的跨样本可比性： 表达量单位统一（分子数），不受样本间内参波动影响。
  • 结果直观可解释： 直接反映转录本的真实丰度。
  • 高精度与低偏差： UMI有效校正PCR扩增偏好性。
  • 适用于复杂样本： 在样本内表达水平差异巨大或内参不稳定时优势显著。

四、应用场景

  • 精准医学： 寻找诊断/预后生物标志物，指导个体化用药（需绝对阈值）。
  • 药物研发： 精准评估药物对靶基因的调控效果。
  • 基础研究： 基因调控网络建模、细胞分化/发育动态研究、宿主-病原体互作定量分析。
  • 单细胞研究： 单细胞RNA-seq (scRNA-seq) 的核心定量方法。
  • 临床诊断： 特定基因（如融合基因、癌基因）的绝对定量检测辅助诊断。

五、重要考量

  • 成本： 通常高于常规RNA-seq。
  • 实验设计： UMI引入和文库构建步骤需优化。
  • 生信分析： UMI数据处理和定量算法是关键。
  • 低丰度转录本： 检测极限受限于测序深度和样本起始量。

总结：

绝对定量转录组测序通过UMI技术和精准的生物信息学分析，实现了对基因表达水平的直接、无偏差的分子计数。其核心检测项目围绕绝对表达量展开，包括差异表达、可变剪接、融合基因、等位基因特异性表达等关键分析，为生命科学研究和精准医学应用提供了前所未有的定量精度和跨样本可比性，是深入理解基因表达调控复杂性的强大工具。

关键词： 绝对定量转录组测序，UMI，分子计数，绝对表达量，差异表达基因 (DEGs)，可变剪接 (AS)，融合基因，等位基因特异性表达 (ASE)，跨样本比较。