哺乳细胞蛋白表达

哺乳动物细胞蛋白表达：原理、工艺与应用

作为生产复杂治疗性蛋白（如单克隆抗体、融合蛋白、激素和病毒疫苗）的黄金标准平台，哺乳动物细胞表达系统凭借其卓越的蛋白质折叠、翻译后修饰（PTM）能力和分泌功能，在生物制药和基础研究中占据核心地位。

一、 核心系统选择

1. 常用细胞系：

   • 中国仓鼠卵巢细胞系： 应用最广泛，尤其适用于大规模生产治疗性抗体和重组蛋白。特点包括悬浮生长适应性强、蛋白产量高、能执行复杂的人源化PTM（如糖基化）。
   • 人胚胎肾细胞系： 广泛应用于瞬时表达快速生产蛋白，基础研究和疫苗生产常用。其内源蛋白分泌较低，有利于重组蛋白纯化。
   • 幼仓鼠肾细胞系： 兼具贴壁和悬浮生长能力，常用于病毒载体生产和特定重组蛋白表达。
   • 小鼠骨髓瘤细胞系： 传统用于杂交瘤技术生产抗体，也可用于重组蛋白表达。

2. 宿主选择考量： 需综合权衡目标蛋白特性（大小、复杂性、所需PTM）、表达量要求（瞬时/稳定）、时间成本、培养难度及生产成本。

二、 表达载体设计要素

1. 强效启动子/增强子： 驱动高水平转录（如源自巨细胞病毒、猿猴空泡病毒、人延伸因子等）。
2. 多克隆位点： 便于目的基因插入。
3. 筛选标记基因： 用于稳定转染细胞系的筛选（如抗新霉素、潮霉素、嘌呤霉素基因）。
4. 扩增系统： 在特定系统中使用（如二氢叶酸还原酶基因），通过药物加压提高基因拷贝数。
5. 信号肽序列： 引导蛋白分泌到胞外培养液，利于纯化。
6. 表位标签： 可选添加（如His标签、HA标签、FLAG标签），简化检测和纯化流程。

三、 基因导入方法

1. 瞬时转染：

   • 原理： 直接将重组DNA导入细胞，不整合到基因组，表达时间短（数天至数周）。
   • 方法：
     • 化学法： 使用磷酸钙共沉淀、阳离子聚合物或脂质纳米粒子包裹DNA，促进细胞摄取。
     • 物理法： 电穿孔（高压脉冲使细胞膜形成暂时性孔隙）。
   • 应用： 快速获得少量蛋白用于小规模筛选、功能研究、早期抗原制备。

2. 稳定转染：

   • 原理： DNA整合到宿主基因组，形成能长期、稳定表达目的蛋白的细胞系。
   • 流程： 转染 -> 选择性药物筛选（杀死未整合细胞）-> 单细胞克隆化（筛选高产单克隆）-> 细胞库建立（主细胞库、工作细胞库）。
   • 筛选： 药物抗性筛选（主要方法）、荧光激活细胞分选、有限稀释法筛选单克隆。
   • 应用： 大规模生产治疗性蛋白和疫苗的基石。

四、 细胞培养与表达优化

1. 培养模式：

   • 贴壁培养： 细胞生长于固相表面（滚瓶、多层工厂），传统方法但规模化成本高。
   • 悬浮培养： 细胞在生物反应器中自由悬浮生长，易于放大，是大规模生产的首选。需要适应悬浮生长的细胞系。
   • 灌注培养： 连续或半连续添加新鲜培养基并移除含代谢废物和产物的旧培养基，维持高细胞密度和延长生产期，提高产量。

2. 培养基优化：

   • 基础培养基： 提供必需营养（氨基酸、糖、维生素、无机盐）。
   • 补料策略： 分批补料或连续灌注关键营养物和代谢调节物（如葡萄糖、谷氨酰胺替代物、特定氨基酸、微量元素），维持细胞活力和生产力。
   • 无血清/化学成分确定培养基： 消除血清批次差异和引入外源因子的风险，提高工艺一致性、安全性和可放大性。

3. 工艺参数控制： 严格监控和优化温度、溶氧、pH值、搅拌/剪切力、渗透压以及二氧化碳浓度，对细胞生长、蛋白产量和质量至关重要。

五、 下游加工

1. 收获： 收集含目标蛋白的培养上清液。
2. 澄清： 去除细胞和大的碎片（深层过滤、离心、切向流过滤）。
3. 捕获： 初级纯化，富集目标蛋白（常用亲和层析，如Protein A/G用于抗体，金属螯合层析用于His标签蛋白）。
4. 中度纯化： 进一步去除杂质（离子交换层析、疏水相互作用层析）。
5. 精纯： 去除痕量杂质（如宿主细胞蛋白、DNA、聚集体），提高最终产品纯度（尺寸排阻层析、离子交换层析）。
6. 病毒清除/灭活： 强制步骤，确保生物制品安全（常用低pH孵育、溶剂/去污剂处理、纳滤）。
7. 浓缩与缓冲液置换： 达到所需浓度和制剂缓冲液条件（超滤/透析）。
8. 除菌过滤： 灌装前进行无菌过滤。

六、 核心优势

1. 精确的翻译后修饰： 能正确进行复杂的人源化糖基化（影响蛋白稳定性、半衰期、免疫原性和功能活性）、磷酸化、乙酰化、硫酸化、正确二硫键形成等。
2. 高效的蛋白折叠与组装： 内质网和高尔基体环境保障复杂多亚基蛋白（如抗体）的正确折叠和组装。
3. 分泌能力： 天然分泌机制便于产物从培养液中收获纯化。
4. 生产复杂蛋白能力： 唯一能生产某些具有复杂PTM或大分子结构的蛋白（如全长抗体、具有特定糖型的促红细胞生成素、某些凝血因子）的系统。

七、 应用领域

1. 治疗性蛋白药物： 单克隆抗体、抗体片段、融合蛋白（如受体-Fc融合）、细胞因子、激素（如促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子）、凝血因子、酶替代疗法产品等。
2. 疫苗： 病毒样颗粒疫苗、重组病毒载体疫苗、重组亚单位疫苗。
3. 病毒载体生产： 用于基因治疗和疫苗的重组腺相关病毒、慢病毒等。
4. 基础研究与试剂： 体外研究蛋白质功能、结构生物学（蛋白质结晶）、诊断试剂开发、细胞信号通路研究所需的重组蛋白。
5. 生物仿制药： 生产与已上市原研生物药高度相似的生物制品。

八、 挑战与趋势

1. 挑战：

   • 成本高昂： 培养基、设备、纯化耗材及细胞培养周期长导致成本显著高于其他系统。
   • 工艺复杂： 细胞培养条件严苛，放大过程需克服众多工程技术难题；下游纯化步骤多且复杂。
   • 时间长： 建立高产稳定细胞系通常耗时数月。
   • 产物异质性： 糖基化等PTM可能存在微不均一性，需严格控制以确保批次一致性。
   • 污染风险： 微生物、支原体、病毒污染风险需持续严格防控。

2. 发展趋势：

   • 细胞株工程改造： 基因编辑技术改造宿主细胞，提升产量、优化糖型、降低杂质（如宿主细胞蛋白）表达。
   • 培养基与工艺优化： 开发更高效无血清/化学成分确定的培养基，优化补料和灌注策略以实现更高滴度和质量。
   • 连续生产工艺： 整合上游连续灌注和下游连续纯化，提高设备利用率、生产效率和产品一致性。
   • 过程分析技术： 加强在线、实时监测和控制，实现质量源于设计。
   • 新型表达系统探索： 如利用特定启动子元件诱导更高表达，或开发新型宿主细胞系。
   • 无启动子表达系统探索： 将目的基因整合至基因组特定高表达位点，减少对外源启动子的依赖。
   • AI与机器学习应用： 应用于细胞株筛选、培养基优化、工艺建模与预测。

总结：

哺乳动物细胞表达系统以其无可比拟的蛋白质翻译后修饰能力和生产复杂功能性蛋白的优势，成为现代生物医药产业的支柱技术。尽管面临成本、周期和工艺复杂性等挑战，持续的科技进步——包括细胞工程、培养工艺革新、连续生产和先进分析技术的应用——正在不断提升其效率、产量和产品质量，降低成本。该技术在开发和生产拯救生命、改善健康的下一代生物制剂（尤其是复杂治疗性蛋白和疫苗）方面，将继续发挥不可或缺的关键作用。