昆虫细胞蛋白表达 - 中析研究所生物检测中心

昆虫细胞蛋白表达：高效真核表达的强大平台

昆虫细胞蛋白表达系统，特别是利用杆状病毒表达载体系统（Baculovirus Expression Vector System, BEVS），已成为生物医学研究和生物制药领域中生产复杂重组蛋白不可或缺的工具。它巧妙地结合了原核系统的操作便捷性与哺乳动物系统的翻译后修饰能力，特别适合表达结构复杂、需要特定折叠或修饰的功能性蛋白质。

核心技术原理与流程

昆虫细胞表达的核心在于利用重组杆状病毒在昆虫宿主细胞（如Sf9、Sf21、High Five™）内高效表达外源基因。

载体构建与重组杆状病毒生成：
- 目的基因克隆： 将目标蛋白的编码序列克隆到杆状病毒转移载体质粒中。该质粒两侧带有杆状病毒基因组的同源臂（如多角体蛋白基因 polh 或 p10 基因的启动子及其侧翼序列）。
- 重组病毒DNA产生： 将重组转移载体与线性化的杆状病毒基因组DNA（通常缺少部分必需基因如 polh）共转染到培养的昆虫细胞内。
- 细胞内同源重组： 在昆虫细胞内，通过同源重组，目的基因及其强启动子（如 polh 或 p10）被整合到病毒基因组中，替代了缺失的部分，形成完整的、具有感染能力的重组杆状病毒（Bacmid）。
- 病毒扩增： 收获含有重组病毒的培养上清，感染更多的昆虫细胞进行病毒扩增，获得高滴度的病毒储备液（P1）。通常需要进一步扩增得到P2或P3病毒用于大规模蛋白表达。
蛋白表达：
- 感染与表达： 将处于对数生长期、状态良好的昆虫细胞，以优化的感染复数（MOI, Multiplicity of Infection）感染扩增好的重组杆状病毒储备液。
- 病毒生命周期与蛋白生产： 杆状病毒感染后经历潜伏期、期和晚期。晚期启动子（如 polh, p10）被强烈激活，驱动目的基因在感染后48至72小时达到表达高峰。此时细胞开始裂解，目的蛋白大量释放到培养上清中（如果带有分泌信号肽）或积累在细胞内。
- 收获： 在最佳时间点（通常48-96小时）收获培养上清（针对分泌蛋白）或收集细胞（针对胞内蛋白）。
下游处理：
- 收获物处理： 上清液需离心澄清去除细胞碎片。细胞沉淀需裂解（如超声、匀浆、去垢剂处理）以释放胞内蛋白。
- 纯化： 采用亲和层析（如His-tag, GST-tag）、离子交换层析、分子筛层析、疏水相互作用层析等多种层析技术或其组合进行蛋白纯化。纯化策略取决于蛋白特性（大小、电荷、疏水性、标签等）和最终应用要求。
- 浓缩与缓冲液置换： 纯化后的蛋白溶液通常需要浓缩并进行缓冲液置换，以适应储存或后续实验需求。
- 分析与验证： 通过SDS-PAGE、Western Blotting确认蛋白大小和特异性；通过质谱、N端测序验证序列完整性；通过功能性实验（如酶活测定、结合实验）验证蛋白活性；通过糖谱分析等评估糖基化修饰。

核心优势

强大的翻译后修饰能力：
- 糖基化： 能进行N-连接和O-连接糖基化，其糖型结构介于原核（无或简单）和哺乳动物（复杂）之间，主要为无核心岩藻糖的寡甘露糖型或少量杂合型。这对于许多需要糖基化才能发挥正确功能的蛋白质（如抗体、受体、酶）至关重要，产生的蛋白通常具有良好的溶解性和稳定性。
- 磷酸化、酰基化、分泌信号肽切割： 能高效完成复杂的磷酸化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化等修饰，并能正确切割分泌信号肽。
- 二硫键形成与折叠： 具有完备的氧化折叠环境，能高效、正确地形成分子内和分子间二硫键，促进复杂蛋白（如多亚基蛋白、抗体）的折叠和组装。
高表达水平： 晚期启动子（如 polh, p10）驱动能力极强，可实现目的蛋白在感染细胞内超高水平的表达，往往占细胞总蛋白的30%-50%甚至更高，显著简化下游纯化。
安全性高： 杆状病毒宿主范围严格局限于无脊椎动物（主要是昆虫），对人类、其他哺乳动物及植物完全无毒、无致病性，表达产物生物安全性高。操作通常在BSL-1或BSL-2实验室即可进行。
兼容性强： 可表达非常大的蛋白（>150 kDa）和复杂的多蛋白复合物（如病毒样颗粒VLP）。通过多启动子载体或多基因Bacmid系统，可实现多个亚基在同一细胞内同时表达并组装。
规模化潜力： 昆虫细胞（如Sf9）易于在无血清悬浮培养中高密度生长（可达数百万/mL），非常适用于摇瓶、转瓶、生物反应器（批次、流加、灌流培养）进行大规模蛋白生产。

应用领域

结构生物学： 生产高纯度、高质量（正确折叠修饰）的蛋白用于X射线晶体学、冷冻电镜（Cryo-EM）和核磁共振（NMR）研究。
功能研究与生化分析： 提供具有天然活性的酶、受体、离子通道、转录因子等，用于酶动力学、配体结合、信号通路研究。
疫苗开发： 大规模生产病毒样颗粒（VLPs）作为安全有效的疫苗候选物（如HPV疫苗、流感疫苗、新冠疫苗等）。也用于生产亚单位疫苗抗原。
治疗性蛋白生产： 生产复杂的生物药物，如单克隆抗体（mAb）片段、融合蛋白、细胞因子、酶替代疗法中的酶等。
诊断试剂开发： 生产高特异性和灵敏度的抗原或抗体，用于免疫诊断试剂盒。
病毒学研究： 研究病毒蛋白功能、组装及宿主相互作用。

挑战与考量

糖基化差异： 昆虫细胞的糖基化途径与哺乳动物存在差异（缺少某些糖基转移酶），缺乏末端唾液酸化，核心岩藻糖化较少或无，主要产生寡甘露糖型结构。虽然这对于许多应用（如结构研究、VLP疫苗）通常足够甚至有益（减少了免疫原性风险），但对于需要精确人类糖型的治疗性蛋白（尤其是需要ADCC功能的抗体），可能需要工程化改造昆虫细胞系（人源化糖基化细胞系）或后续进行糖基化修饰。
杆状病毒裂解性： 病毒感染的最终结果是宿主细胞裂解死亡，因此表达过程本质上是“分批”的，无法进行连续培养。需要定期接种新的细胞进行生产。
工艺复杂性： 涉及病毒的扩增、滴定和感染优化（MOI, 时间），流程比瞬时转染的哺乳动物细胞系统或稳定的CHO细胞系稍长，操作技术要求较高。
非内源性伴侣蛋白： 对于某些非常复杂的哺乳动物蛋白，昆虫细胞内可能缺乏特定的分子伴侣或折叠因子，影响其正确折叠或活性。
成本： 相较于大肠杆菌系统，昆虫细胞培养和无血清培养基的成本相对较高。

技术进展

无血清/化学成分限定培养基： 提高培养一致性、简化下游纯化、降低血清批次差异风险和病毒污染风险。
稳定转化昆虫细胞系： 利用可诱导启动子（如蜕皮激素诱导系统）或跳跃转座子（如PiggyBac）建立稳定表达目的蛋白的昆虫细胞系，避免了病毒扩增步骤，更适用于需要长期、连续生产的需求。
基因组编辑： 利用CRISPR/Cas9等技术对昆虫宿主细胞进行基因工程改造，例如“人源化”其糖基化途径（引入关键的人源糖基转移酶基因，如β1,4-半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶及其前体合成通路基因），使其能产生更接近人类或复杂哺乳动物细胞的糖型（如双天线复合型带末端唾液酸）。改造细胞系表达特定分子伴侣以辅助复杂蛋白折叠。
新型表达载体： 开发启动子更早、表达动力学更快的载体，缩短表达周期；改进的多基因表达系统。
工艺优化： 生物反应器工艺（灌流、流加）优化以提高细胞密度和蛋白产量；感染策略优化（如时间、MOI、同步性）。

小结

昆虫细胞蛋白表达系统，凭借其卓越的翻译后修饰能力（尤其是糖基化、折叠和二硫键形成）、极高的表达水平、良好的安全性和不断改进的可放大性，已成为生产结构复杂、功能依赖严格折叠和修饰的重组蛋白的首选平台之一。它在结构生物学、疫苗开发（尤其是VLP）、治疗性蛋白研究和功能基因组学等领域发挥着不可替代的作用。虽然糖型和细胞裂解特性存在固有挑战，但持续的工程技术创新（如人源化糖基化细胞系、稳定表达系统）正在不断拓展其应用边界，使其在生物技术和生物制药领域继续保持强大竞争力。选择表达系统时，需综合考虑目标蛋白特性、所需修饰、产量、时间、成本和最终应用目的，昆虫细胞系统无疑为许多需要高质量真核表达的挑战提供了强有力的解决方案。