微量全转录组测序（Smart pico)

微量全转录组测序 (SMART pico) 完整文章：聚焦检测项目

在生命科学研究中，珍贵的微量样本（如少量细胞、穿刺活检、单细胞分选产物、循环肿瘤细胞等）蕴藏着关键生物学信息。然而，传统RNA测序方法对这些样本束手无策。微量全转录组测序(SMART pico) 技术应运而生，它基于SMART (Switching Mechanism at 5' end of RNA Template) 技术，实现了对极低起始量RNA（低至皮克级）的全面转录组分析。本文重点解析其核心检测项目及应用价值。

一、 SMART pico 技术核心：突破微量样本瓶颈

• 核心原理： 利用SMART技术特有的模板转换机制。
  • 使用特殊设计的Oligo dT引物捕获带polyA尾的RNA。
  • 逆转录酶在合成cDNA第一链到达mRNA 5'端时，会“切换模板”，在cDNA末端添加一段特殊序列。
  • 通过PCR引入测序接头，构建高质量、全长或接近全长的cDNA文库。
• 核心优势：
  • 超低起始量： 仅需10pg - 10ng 总RNA 或1 - 1000个细胞，突破传统方法限制。
  • 高灵敏度： 有效检测低丰度转录本。
  • 全长覆盖： 可获得接近全长的转录本信息，有利于异构体分析。
  • 广谱性： 适用于多种类型样本（细胞、组织、FFPE、体液等）。

二、核心检测项目：绘制全面的转录组图谱

SMART pico 提供的是“全转录组”视图，其核心检测项目涵盖几乎所有主要RNA类型：

1. 信使RNA (mRNA)：

   • 基因表达定量： 这是最核心的应用。精确检测数万个基因的表达水平（Read Counts, FPKM/RPKM, TPM）。重点： 揭示不同样本（如疾病vs健康、处理vs对照）间的差异表达基因(DEGs)，用于生物标志物发现、通路分析、分子分型等。
   • 可变剪接(AS)： 检测外显子跳跃、内含子保留、可变5'/3'剪接位点等事件。重点： 研究基因功能调控、疾病发生机制（如癌症中剪接因子突变导致异常剪接）。
   • 融合基因(Fusion Genes)： 检测染色体易位/重排产生的融合转录本。重点： 在癌症研究（如白血病、肉瘤、肺癌）中作为诊断标志物和治疗靶点（如BCR-ABL）。

2. 长链非编码RNA (lncRNA)：

   • 检测数以万计的lncRNA表达水平。重点： lncRNA在基因表达调控（表观遗传、转录、转录后）、细胞分化、发育、疾病（尤其是癌症）中起关键作用，是研究热点。

3. 环状RNA (circRNA)：

   • 通过识别反向剪接位点(junction reads)检测circRNA。重点： circRNA具有稳定性高、组织特异性强等特点，可作为疾病诊断标志物或参与miRNA海绵作用调控基因表达。

4. 微小RNA前体 (pre-miRNA)：

   • 检测具有发夹结构的pre-miRNA。重点： 间接反映成熟miRNA的潜在丰度，用于研究与miRNA生物合成相关的调控机制。

三、 重要信息与延伸解读

1. 覆盖范围：
   • 主要覆盖： 所有带polyA尾的RNA。这包括绝大部分mRNA、绝大部分lncRNA、部分circRNA（含polyA尾或内部序列被捕获）、pre-miRNA。
   • 不直接覆盖： 非polyA RNA（如部分lncRNA、circRNA）、rRNA、tRNA、sn/snoRNA（除非特别设计去除rRNA）。通常需在文库构建前去除rRNA以提高有效数据量。
2. 关键分析维度：
   • 表达谱： 绝对和相对定量分析。
   • 差异分析： 组间比较，寻找显著性变化的基因/转录本。
   • 功能富集分析： (GO, KEGG等) 解读DEGs或差异lncRNA/circRNA相关的生物学过程、通路、功能。
   • 共表达网络分析： 构建基因/转录本间的调控网络。
   • 可变剪接分析： 量化不同剪接事件的发生率。
   • 融合基因检测： 识别并验证高置信度的融合事件。
   • 新转录本发掘： 结合基因组注释，可发现新的剪接变体或新型lncRNA/circRNA。
3. 技术局限性与注意事项：
   • 同源基因区分： 对高度同源的基因家族成员，区分可能不够精准。
   • 绝对定量： 提供的是相对丰度比较，非绝对分子数。
   • 融合基因假阳性： 需严格生物信息学过滤和实验验证（如PCR、Sanger测序）。
   • 单细胞应用： 虽可做少量细胞，但严格意义上的单细胞分辨率需结合单细胞分离技术（如液滴微流控），此时称为单细胞RNA测序(scRNA-seq)，其文库构建常基于SMART原理。
   • 数据量与成本： 获得足够深度用于复杂分析（如可变剪接、新转录本）需要较高的测序深度，成本相应增加。
   • 生物信息学挑战： 数据分析复杂，需要专业知识和计算资源。

四、 应用领域 (体现检测项目的价值)

1. 肿瘤研究：
   • 肿瘤分子分型： 基于mRNA/lncRNA表达谱对肿瘤进行精确分类。
   • 生物标志物发现： 寻找诊断、预后、疗效预测相关的DEGs、lncRNA、circRNA、融合基因。
   • 耐药机制研究： 比较耐药/敏感细胞的转录组差异。
   • 液体活检： 分析循环肿瘤细胞(CTCs)或循环肿瘤RNA(ctRNA)中的转录组信息。
2. 发育生物学与干细胞研究：
   • 追踪少量干细胞/祖细胞在分化过程中的动态转录组变化。
   • 研究胚胎早期发育关键事件的基因调控网络。
3. 神经科学：
   • 分析特定神经元亚群（通过显微解剖或分选）的转录组。
   • 研究神经发育、退行性疾病、精神疾病的分子机制。
4. 免疫学：
   • 分析稀有免疫细胞亚群（如抗原特异性T细胞、干细胞样记忆T细胞）的功能状态。
5. 临床诊断与精准医疗：
   • 利用穿刺活检等微量样本进行分子诊断（如融合基因检测）。
   • 指导靶向治疗和免疫治疗。
6. 药物研发：
   • 评估药物对微量细胞模型（如原代细胞、类器官）的转录组影响，进行药物筛选和机制研究。

五、 应用建议

• 样本质量优先： 即使样本量少，也要保证RNA完整性和纯度。快速处理、使用保护剂。
• 严谨实验设计： 设置足够生物学重复（≥3）以提高统计效力。明确对照组。
• 明确分析目标： 根据核心科学问题（如侧重DEGs？剪接？融合？lncRNA？）决定测序深度和数据分析策略。
• 验证关键发现： 对重要的DEGs、可变剪接事件、融合基因、新型RNA，务必用独立方法（qPCR, ddPCR, Northern Blot, Sanger测序等）进行验证。
• 寻求合作： 与生物信息学专家紧密合作，确保数据分析的准确性和深度解读。

总结：

微量全转录组测序(SMART pico)是解锁珍贵微量样本转录组信息的强大工具。其核心价值在于能够从极少的细胞或RNA中，全面检测mRNA（基因表达、可变剪接、融合基因）、lncRNA、circRNA和pre-miRNA等关键转录本。通过绘制这些全面的转录组图谱，研究人员能够在肿瘤学、发育生物学、神经科学、免疫学、临床诊断和药物研发等多个领域，深入探索生命过程的分子机制、发现疾病相关的生物标志物和靶点，最终推动基础科学发现向临床应用的转化。理解其检测项目的范围和特点，结合严谨的实验设计和深入的数据分析，是最大化利用该技术潜力的关键。