抗菌活性试验

发布时间：2025-06-16 08:53:32 阅读量：4 作者：生物检测中心

抗菌活性试验：原理、方法与应用

一、 引言

抗菌活性试验是评估化学物质、天然提取物、合成化合物或生物材料抑制或杀灭微生物（主要是细菌和真菌）能力的标准化实验方法。它在多个领域具有核心地位：

  • 药物研发: 筛选和评价新型抗生素及抗菌药物的效力。
  • 天然产物研究: 发掘植物、微生物或其他天然来源中具有抗菌潜力的活性成分。
  • 材料科学: 评估抗菌涂层、医疗器械、包装材料等的抗菌性能。
  • 环境监测: 检测环境中抗菌剂残留及耐药性发展。
  • 质量控制: 确保消毒剂、防腐剂、抗菌日化产品的有效性。

二、 抗菌活性试验的核心原理

这些试验基于一个核心观察：当待测样品（抗菌剂）与微生物接触时，会对微生物的生长、繁殖或生存产生可检测的影响。这种影响表现为：

  1. 抑菌作用 (Bacteriostasis/Fungistasis): 抑制微生物的生长和繁殖，但不直接杀死它们。移除抗菌剂后，微生物可能恢复生长。
  2. 杀菌作用 (Bacteriocidal/Fungicidal): 直接杀死微生物，导致微生物数量不可逆地减少。

三、 常用抗菌活性试验方法

根据试验目的和原理，主要分为定性、定量和扩散法：

(一) 定性方法 (初步筛选)

  1. 琼脂扩散法 (Agar Well/Disc Diffusion Method)：
    • 原理： 将含有待测样品的滤纸片（纸片扩散法）或直接向琼脂平板上的孔穴（孔穴扩散法）加入样品溶液。样品在琼脂中扩散，形成浓度梯度。培养后，观察样品周围形成的透明区域（抑菌圈）。
    • 结果解读： 抑菌圈直径大小通常与样品的抗菌活性呈正相关（需结合样品溶解性、扩散速率等因素综合判断）。是快速筛选大量样品的常用方法。
    • 标准化参考： 改良Kirby-Bauer法常用于临床药敏试验，有严格的判定标准和解释表格。

(二) 定量方法 (精确测定)

  1. 最小抑菌浓度 / 最小杀菌浓度 (MIC/MBC Determination)：

    • 原理 (MIC): 在液体培养基（肉汤稀释法）或固体培养基（琼脂稀释法）中，制备一系列成倍稀释的待测样品浓度梯度。接种定量微生物，培养后观察。MIC 是指完全抑制微生物可见生长的最低样品浓度。
    • 原理 (MBC): 通常基于MIC试验。将无可见生长的试管内容物接种到不含抗菌剂的新鲜培养基上，继续培养。MBC 是指能使活菌总数减少 ≥ 99.9% (或降低3个log值) 的最低样品浓度。
    • 结果解读： MIC/MBC是评价抗菌效力的核心定量指标，数值越低，表明效力越强。对于杀菌剂，MBC通常接近或等于MIC；对于抑菌剂，MBC显著高于MIC。

  2. 时间-杀伤曲线 (Time-Kill Curve Assay)：

    • 原理： 在固定浓度的待测样品中接种微生物，在不同时间点取样，通过平板菌落计数法测定存活微生物数量。绘制活菌数对数值随时间变化的曲线。
    • 结果解读： 可动态观察抗菌剂的杀菌速率、杀菌程度以及是否存在持续效应或复苏现象。能区分是浓度依赖型还是时间依赖型杀菌。

(三) 其他相关方法

  1. 生物被膜试验 (Biofilm Assays)：

    • 原理： 在特定载体（如微孔板、生物膜反应器）上培养微生物形成生物被膜，然后定量评估抗菌剂对已形成生物被膜的清除或抑制能力。常用结晶紫染色定量生物膜量、活菌计数、XTT法测代谢活性等。
    • 意义： 生物被膜状态的微生物对抗菌剂的耐药性显著增强，此试验更贴近实际感染场景。

  2. 联合药敏试验 (Checkerboard Assay)：

    • 原理： 在微孔板中同时设置两种抗菌剂不同浓度的组合，接种微生物培养后测定MIC。计算部分抑菌浓度指数 (FICI) 来判断两药相互作用是协同、相加、无关还是拮抗。
    • 意义： 指导临床联合用药方案，提高疗效或克服耐药性。

四、 关键实验步骤与注意事项

  1. 微生物选择与准备：
    • 选择标准菌株（如ATCC菌株）或临床分离株（需明确鉴定）。
    • 使用处于对数生长期的均一菌悬液，通常用0.5麦氏浊度标准调整菌液浓度。
  2. 培养基：
    • 根据测试微生物选择合适且成分明确的培养基（如Mueller-Hinton肉汤/琼脂用于需氧细菌）。确保不含拮抗物质。
  3. 样品制备：
    • 确保样品在培养基或溶剂（如无菌水、DMSO、乙醇等）中充分溶解或均匀分散，注意溶剂本身无抗菌活性且对微生物无毒。
  4. 阴性/阳性对照：
    • 阴性对照： 不含抗菌剂的培养基+微生物（验证微生物正常生长）。
    • 阳性对照： 已知有效抗菌剂（验证试验系统有效）。
    • 溶剂/空白对照： 只含溶剂的培养基+微生物（排除溶剂影响）。
  5. 培养条件：
    • 严格控制温度（通常35-37°C）、时间（通常16-24小时）和气体环境（需氧、厌氧、微需氧）。
  6. 结果判读：
    • 抑菌圈： 精确测量直径（包括纸片/孔本身直径），通常在反射光下观察。
    • MIC： 肉眼观察无可见浑浊（肉汤法）或无单个菌落生长（琼脂法）。微量肉汤稀释法常用比浊仪辅助。
    • MBC/活菌计数： 保证取样和稀释操作的准确性。
  7. 生物安全：
    • 在相应生物安全等级的实验室操作，严格遵守无菌操作规范，防止微生物污染和人员感染。废弃物需灭菌处理。

五、 结果解读与应用

  • 抑菌圈直径： 提供初步活性信息及相对强度比较。需参照标准解释图表（如针对特定抗生素和菌种）才有临床意义。
  • MIC/MBC： 是评价抗菌效力的金标准。解释需结合：
    • 抗菌剂的药代动力学/药效学(PK/PD)参数（如Cmax/MIC, AUC/MIC）。
    • 微生物的敏感性折点 (Breakpoints)，通常由权威机构（如CLSI, EUCAST）制定，用于定义“敏感”、“中介”、“耐药”。
    • 试验目的（筛选高活性物质 vs. 判断临床用药有效性）。
  • 时间-杀伤曲线： 提供动态杀菌信息，指导给药方案（如给药间隔、输注时间）。
  • 生物被膜试验： 评估抗菌剂对顽固性生物被膜感染的治疗潜力。
  • 联合药敏： 指导优化临床联合用药策略。

六、 结论

抗菌活性试验是连接基础研究与实际应用不可或缺的工具。选择合适的方法并严格遵守标准化操作规程是获得可靠、可重复结果的关键。准确解读结果需要综合考虑微生物特性、抗菌剂性质、感染部位以及相关的PK/PD原理。随着微生物耐药性问题的日益严峻，不断改进和创新抗菌活性评价方法（如针对耐药机制、持留菌的检测）对于开发新型抗菌策略至关重要。

参考文献示例 (格式省略具体企业)：

  1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing (最新版M100文件).
  2. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) Breakpoint tables (最新版).
  3. Andrews, J. M. (2001). Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48(Suppl_S1), 5-16.
  4. CDC/NHSN 实验室方法指南 (生物被膜相关部分)。
  5. 微生物学、药理学标准教材中关于抗菌试验的章节。