油红O染色详解：组织脂质可视化技术
油红O染色是一种经典的组织化学染色方法，专门用于在冰冻组织切片或细胞涂片（爬片）中特异性显示中性脂质和三酰甘油的存在与分布。其鲜明的红色着色效果使其成为研究脂质代谢、脂肪变性（如脂肪肝、动脉粥样硬化斑块）及脂肪细胞分化和功能的常用技术。
基本原理 油红O是一种脂溶性偶氮染料，具有很强的亲脂性。其染色原理基于“相似相溶”原理：
- 脂溶性染料亲和脂质： 油红O分子自身不溶于水，但极易溶解于脂类物质中。
- 选择性着色： 当含有油红O的染液接触到组织或细胞中的脂滴时，染料分子会从染液中溶解、扩散并优先沉积（溶解）在这些疏水的脂质结构中。
- 颜色显现： 染料沉积后呈现出鲜艳的橙红色至鲜红色，从而清晰标示出脂质的位置。
主要应用
- 病理学研究：
- 检测肝脏脂肪变性（脂肪肝）。
- 观察动脉粥样硬化斑块内的脂质核心。
- 诊断脂肪肉瘤等含脂肿瘤。
- 细胞生物学研究：
- 观察培养细胞（如脂肪细胞、肝细胞、巨噬细胞）内的脂滴形成、积累与分布。
- 研究脂质代谢紊乱（如高脂血症模型）。
- 评估诱导脂肪细胞分化的效果（常用于间充质干细胞研究）。
- 基础研究： 探索脂质在各种生理和病理过程中的作用。
所需试剂与材料
- 油红O原液 (0.5%): 将0.5克油红O粉末溶解于100毫升异丙醇中。充分搅拌溶解（可能需要数小时至过夜），过滤后避光保存于4°C。（注意：这是母液，染色前需配制成工作液）
- 油红O工作液 (60%): 取40毫升蒸馏水，缓慢加入60毫升油红O原液（0.5%），边加边搅拌混合均匀。静置平衡至少10分钟（静置20-30分钟效果更佳），染色前用滤纸过滤。工作液需现配现用！(比例：原液：水 = 3：2)
- 固定剂： 10%中性福尔马林缓冲液（推荐）、甲醛钙溶液、4%多聚甲醛等。避免使用含醇固定液（如乙醇）。
- 分化液： 85%异丙醇溶液（用于去除非特异性背景着色）。
- Harris苏木素染液 (或 Mayer’s 苏木素)： 用于复染细胞核。
- Scott蓝化液 (或 0.02-0.05%氨水)： 使苏木素染色的细胞核变蓝。
- 封片介质： 水性封片剂（如甘油明胶）。严禁使用含二甲苯的树胶封片（会导致染料溶解褪色）！
- 其他： 蒸馏水、磷酸盐缓冲液（PBS）、载玻片、盖玻片、染色缸、湿盒、显微镜等。
操作步骤 (以冰冻切片为例)
- 样本准备：
- 组织块：新鲜组织经OCT包埋剂包埋，在冷冻切片机中切片（厚度通常为5-10μm）。直接贴附于载玻片上。
- 细胞：细胞涂片或培养在盖玻片上的细胞（爬片）。常用4%多聚甲醛固定10-15分钟。
- 固定（可选但推荐）： 切片或细胞样本置于10%中性福尔马林缓冲液中固定5-10分钟（固定过度可能导致脂质流失）。
- 漂洗： 蒸馏水或PBS冲洗2次，每次1-2分钟。
- 油红O染色： 将过滤后的新鲜油红O工作液（60%）滴加在待染区域（或将切片浸入染色缸），室温避光染色10-20分钟（最佳时间需根据样本和组织类型稍作优化）。
- 分化： 快速浸入85%异丙醇分化液中提插数次（约10-30秒），至背景基本无色、仅脂质呈红色为止。（分化是关键步骤，需在显微镜镜下控制）
- 漂洗： 流动自来水充分冲洗5分钟以上，彻底去除分化液和残留染料。
- 复染核： Harris苏木素染液复染细胞核1-2分钟。
- 蓝化： 自来水冲洗后，浸入Scott蓝化液（或稀氨水）中蓝化数秒至核呈蓝色。
- 漂洗： 流水冲洗5-10分钟。
- 封片： 用滤纸吸去多余水分（切勿完全干燥切片），立即用水性封片剂（甘油明胶）进行湿封。小心盖上盖玻片，避免气泡。
结果判读
- 阳性： 中性脂质（脂滴）呈现鲜艳的橙红色至鲜红色。着色强度通常反映脂质的含量和密度。
- 细胞核： 经苏木素复染呈蓝色。
- 背景： 应为无色或非常淡的粉红色。
注意事项与技巧
- 样本新鲜度： 组织离体后应尽快冷冻切片染色，防止脂质水解或移位。避免使用石蜡包埋样本（脂质在处理过程中会被溶解）。
- 切片厚度： 冰冻切片不宜过厚（推荐5-10μm），过厚易导致背景深、脂滴轮廓不清。
- 固定选择： 推荐使用10%中性福尔马林缓冲液短暂固定（5-10分钟）。过度固定会溶解部分脂质。避免使用乙醇、丙酮等有机溶剂固定！
- 工作液配制与过滤： 工作液需现配现用，染色前必须过滤，去除任何可能导致非特异性沉淀的染料颗粒。
- 染色时间： 10-20分钟是常用范围，但需根据样本类型、切片厚度和室温调整。染色不足脂质着色浅；过度染色背景深。
- 分化控制： 85%异丙醇分化是成败关键。时间太短背景深；时间太长脂质着色也被洗脱。必须在显微镜下监控分化终点（背景基本无色，脂质保持明亮红色）。
- 漂洗充分： 分化后流水冲洗务必彻底，否则残留分化液会影响后续复染和封片。
- 避免干燥： 从最后水洗到封片过程中，切片始终不能完全干燥，否则染料会形成结晶样沉淀，破坏染色形态。
- 封片介质： 务必使用水性封片剂（如甘油明胶）。二甲苯和树脂封片剂会瞬间溶解油红O染料，导致阳性信号完全消失！
- 结果保存： 油红O染色切片相对稳定，避光4°C保存可维持数周至数月，但长期保存仍可能褪色。建议及时拍照记录。
常见问题分析
- 背景深/弥漫性着色： 工作液未过滤、染色过度、分化不足、切片过厚、固定液残留未洗净。
- 阳性信号弱或无： 脂质含量低、染色时间不足、分化过度、组织处理不当导致脂质丢失（如使用了有机溶剂）、工作液失效、封片介质错误导致染料溶解。
- 染料沉淀（镜下可见红色颗粒）： 染色过程中切片干燥、工作液未过滤干净、染色后冲洗不充分。
- 核复染过深/过浅： 苏木素染色时间不当或苏木素老化。
安全提示
- 油红O、异丙醇、福尔马林、二甲苯（如配制原液或清洗）等试剂均具有一定毒性或刺激性。操作时务必在通风橱内进行，佩戴手套、口罩和防护眼镜。
- 废弃物按照实验室规定妥善处理。
总结 油红O染色是一种操作相对简便、结果直观可靠的组织化学染色技术，是研究中性脂质在组织细胞中分布的金标准方法之一。掌握其原理、精确控制分化步骤、使用正确的封片介质以及注意避免样本干燥，是获得高质量、特异性染色结果的关键。该技术广泛应用于病理诊断、基础医学研究和细胞生物学领域，为揭示脂质相关的生理和病理过程提供了重要的形态学依据。
(图示说明：理想染色结果应显示细胞质内大小不一的橙红色脂滴，细胞核呈蓝色，背景洁净。)