番红固绿染色

番红固绿染色：植物组织学研究的经典搭档

在植物组织学研究的工具箱中，番红固绿染色法以其操作相对简便、结果对比鲜明且能有效区分植物组织中几种关键成分的特点，历经时间考验，成为广泛应用和研究不可或缺的经典技术。它巧妙地利用两种染料——番红（Safranin O）和固绿（Fast Green FCF）——的特性，赋予植物切片丰富的色彩信息。

一、原理与目的

• 番红（Safranin O）： 一种强碱性阳离子染料（醌亚胺类）。它主要与植物组织中带负电荷的成分结合，表现出极强的亲和力。这些成分主要包括：
  • 木质化细胞壁： 如木质部导管、管胞、纤维、石细胞。
  • 细胞核： 细胞核内的染色质和染色体富含核酸（带负电）。
  • 染色体： 在细胞分裂期清晰可见。
  • 角质层： 表皮细胞外壁的蜡质层。
  • 木栓层： 周皮的主要组成部分。
  • 粘液： 某些细胞分泌的物质。染色结果通常呈现鲜艳的红色或红紫色。
• 固绿（Fast Green FCF）： 一种酸性阴离子染料（三苯甲烷类）。它主要与带正电荷或特定结构的成分结合，对番红的染色部位亲和力弱。主要染色对象包括：
  • 纤维素细胞壁： 如薄壁组织、厚角组织、韧皮部筛管和伴胞、表皮细胞的非木质化部分。
  • 细胞质： 通常染色较浅。
  • 含蛋白质丰富的结构。 染色结果通常呈现绿色或蓝绿色。

目的： 通过这两种染料的选择性着色，番红固绿染色法能清晰地区分和展示植物组织中的：

1. 木质化组织（红/红紫）与非木质化组织（绿/蓝绿）。
2. 厚壁组织与薄壁组织。
3. 输导组织（木质部红，韧皮部绿）。
4. 细胞核（红）与细胞质背景（绿）。
5. 表皮及其附属结构（角质层常红，表皮细胞壁绿）。
6. 周皮（木栓层红，栓内层绿）。 这种鲜明的色彩对比（红-绿互补色）为研究植物的解剖结构、组织分化、发育过程以及病理变化提供了直观且信息丰富的图像。

二、染色步骤（石蜡切片法示例）

所需主要试剂（通用名称）：

1. 系列乙醇（浓度梯度：100%，95%，85%，70%，50%）
2. 无水乙醇
3. 二甲苯（或替代性透明剂）
4. 番红染液（番红溶于特定浓度乙醇溶液或蒸馏水）
5. 固绿染液（固绿溶于特定浓度乙醇溶液，常用95%乙醇）
6. 蒸馏水
7. 1%盐酸乙醇分化液（70%乙醇配制）
8. 中性树胶封固剂

标准流程：

1. 脱蜡与水化：

   • 切片经二甲苯 I、II 充分脱蜡（各约 5-10 分钟）。
   • 无水乙醇 I、II 洗去二甲苯（各约 2-3 分钟）。
   • 依次经过 95%、85%、70%、50% 乙醇下行至蒸馏水（各约 1-2 分钟），使组织充分水化。

2. 番红染色：

   • 将切片浸入 番红染液 中染色。染色时间根据染液浓度、组织类型和室温调整，通常需要 2 小时至数小时，或进行 过夜染色（效果更稳定饱满）。
   • 取出切片，用蒸馏水稍洗去浮色。

3. 分化与脱水（部分）：

   • 用 1% 盐酸乙醇（70%乙醇） 分化。此步骤至关重要，目的是洗去组织切片中非木质化区域（如薄壁组织、细胞质）过度吸附的番红染料，仅保留木质化结构和细胞核的红色。分化时间需在显微镜下密切监控（通常仅需数秒至数十秒），直至薄壁组织呈淡粉色或近无色，而木质部等保持鲜红。
   • 分化后，立即用 70% 乙醇 洗涤数次以彻底终止分化作用。
   • 依次经 85% 乙醇 → 95% 乙醇 I 脱水（各约 1-2 分钟）。此时切片应主要在木质化部分和核呈红色，其余部分基本无色或淡粉色。

4. 固绿复染：

   • 将切片浸入 固绿染液（95%乙醇配制） 中复染。染色时间较短，通常 10 秒至 1 分钟（需根据染液浓度和经验调整）。过染会导致绿色过深掩盖结构。
   • 迅速取出切片。

5. 脱水与透明：

   • 立即用 95% 乙醇 II 快速洗涤切片，洗去多余浮色。动作需快，防止固绿脱色过多。
   • 转入 无水乙醇 I、II 彻底脱水（各约 1-2 分钟）。
   • 转入 二甲苯 I、II 透明（各约 2-5 分钟），使组织透明利于透光观察。

6. 封片：

   • 取出切片，吸去多余二甲苯（避免干燥）。
   • 滴加适量中性树胶，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。
   • 放置于通风处待树胶完全固化。

三、结果判读

• 鲜红/红紫色： 木质化细胞壁（导管、管胞、纤维、石细胞）、木栓层、角质层、细胞核、染色体。
• 绿色/蓝绿色： 纤维素细胞壁（薄壁组织、厚角组织、韧皮部、表皮细胞壁）、细胞质背景（通常较浅）。
• 对比效果： 木质部（红）与韧皮部（绿）；厚壁组织（红）与薄壁组织（绿）；表皮角质层（红）与表皮细胞壁（绿）；细胞核（红）与细胞质（绿）形成鲜明对比。

四、应用领域

• 植物解剖学研究： 观察根、茎、叶、花、果实、种子的内部结构，识别各类组织（表皮、皮层、维管束、髓、分生组织等）及细胞类型。
• 植物发育生物学： 研究器官发生、组织分化（如维管组织发育）、细胞分裂与伸长等过程。
• 木材鉴定与结构分析： 显示生长轮、各类细胞（导管、木纤维、木射线）的形态和分布。
• 植物病理学： 观察病原菌侵染（如菌丝、孢子）、寄主组织反应（木质化、坏死等）。
• 教学实验： 广泛应用于生物学、农学、林学、园艺学的实验教学中，帮助学生直观理解植物组织结构。

五、注意事项

1. 分化是关键： 番红分化不足会导致背景过红，掩盖固绿的绿色，切片浑浊；分化过度则木质部颜色变浅甚至丢失，核染色变淡。需严格控制时间和显微镜下监控。
2. 固绿染色时机： 固绿染色时间短且易溶于乙醇，染色后进入95%乙醇洗涤步骤必须迅速，避免绿色脱失过多。
3. 脱水透明彻底： 脱水不彻底会导致切片进入二甲苯时浑浊（白色云雾状），影响透明度和最终观察。
4. 封片防干： 透明后封片前，避免切片在空气中暴露过久导致干燥，否则会产生干燥裂纹和气泡。
5. 试剂安全： 二甲苯、乙醇等试剂易燃、易挥发且有毒性，操作需在通风橱中进行，做好个人防护（手套、口罩）。
6. 染液稳定性： 番红染液相对稳定，固绿染液（尤其醇溶性）稳定性稍差，久置可能效果下降，宜新鲜配制或注意保存条件。
7. 切片厚度： 通常适用于8-15微米厚的石蜡切片。过厚可能导致染色不均、分化困难。

六、试剂配制参考（示例浓度）

• 番红染液（1%水溶液）： 番红1g，溶解于100ml蒸馏水中。过滤后使用。也可用50%或70%乙醇配制。
• 固绿染液（0.1%乙醇溶液）： 固绿0.1g，溶解于100ml 95%乙醇中。过滤后使用。
• 1%盐酸乙醇分化液： 浓盐酸1ml，加入到99ml 70%乙醇中，混匀。

总结：

番红固绿染色法通过两种染料对植物组织不同化学成分的选择性亲和力，实现了对木质化结构、细胞核（红）与纤维素结构、细胞质（绿）的清晰、对比鲜明的双重染色。其操作流程虽需细致控制分化等关键步骤，但因其可靠性高、成本相对较低、结果信息丰富且易于解读，使其在植物组织学研究、教学和病理诊断中保持着持久的生命力，成为揭示植物微观世界奥秘的经典工具。掌握这一技术，对于深入理解植物的结构、功能和与环境互作至关重要。