原位杂交

原位杂交技术：从原理到应用

原位杂交（In Situ Hybridization, ISH）是一种强大的分子细胞生物学技术，能在保持细胞或组织原始形态结构的同时，精确定位特定核酸序列（DNA或RNA）的空间位置。它结合了分子杂交的特异性与组织学定位的直观性，成为研究基因表达模式、染色体结构、病原体检测及细胞分化机制不可或缺的工具。

一、 核心技术原理

ISH的核心基于核酸碱基互补配对原则（A-T/U, G-C）。

1. 探针制备：

   • 设计与目标核酸序列互补的标记探单链或双链核酸片段作为探针。
   • 探针类型多样：寡核苷酸探针（短，特异性高）、cRNA探针（即核糖探针，RNA-RNA杂交稳定）、cDNA探针（DNA-RNA杂交）、基因组DNA探针等。
   • 标记物： 探针需预先标记以便后续检测。标记物主要包括：
     • 放射性同位素： 如³²P, ³⁵S, ³H。通过放射自显影检测，灵敏度高，但存在安全风险、周期长、分辨率受限。
     • 非放射性标记物（主流）：
       • 荧光素： 如FITC, Cy3, Cy5, Alexa Fluor系列。用于荧光原位杂交（FISH），可直接观测，支持多色标记。
       • 半抗原： 如地高辛配基（Digoxigenin, DIG）、生物素（Biotin）。需与偶联了酶（碱性磷酸酶AP、辣根过氧化物酶HRP）或荧光素的抗体/亲和素进行反应，再通过显色底物（产生沉淀）或荧光信号进行检测。灵敏度高，安全性好。

2. 样本处理：

   • 固定： 使用多聚甲醛等固定剂快速固定组织或细胞，保持形态结构并固定靶核酸。
   • 切片： 制备石蜡切片或冷冻切片。
   • 通透化： 用蛋白酶K或酸处理增加细胞膜/组织的通透性，利于探针进入。
   • 预杂交/封阻： 使用含有载体DNA/RNA、血清蛋白等的缓冲液封闭非特异性结合位点，降低背景噪音。

3. 杂交反应：

   • 将标记好的探针与处理好的样本在严格控制的条件下（特定温度、盐浓度、甲酰胺浓度）共孵育。
   • 探针通过碱基互补配对原则，特异性结合到样本中的靶核酸序列上。

4. 洗脱：

   • 使用不同严谨度（主要取决于盐浓度和温度）的缓冲液洗去未结合的探针以及非特异性结合的探针，保证特异性。

5. 信号检测：

   • 放射性标记： 将样本与感光胶片或核乳胶接触，进行放射自显影。
   • 荧光标记（FISH）： 在荧光显微镜下直接观察荧光信号。
   • 半抗原标记：
     • 加入偶联了酶（AP或HRP）的抗半抗原抗体（如抗DIG抗体）或亲和素（链霉亲和素结合生物素）。
     • 洗涤去除未结合的抗体/亲和素。
     • 显色/发光：
       • 加入酶的特异性显色底物（如NBT/BCIP用于AP产生蓝紫色沉淀；DAB用于HRP产生棕色沉淀），在酶促反应下生成不溶性有色沉淀沉积在杂交位点，可在普通光学显微镜下观察。
       • 或加入化学发光底物，使用X光片或成像系统检测光信号。
     • 荧光检测（间接FISH）： 加入偶联了荧光的抗半抗原抗体或亲和素，在荧光显微镜下观察信号。

6. 复染与封片：

   • 常用DAPI（染细胞核呈蓝色）、苏木精（染核）或伊红（染细胞质）等染料进行复染，提供组织/细胞的形态背景。
   • 使用封片介质封固玻片，便于长期保存和观察。

二、 主要技术类型

1. 荧光原位杂交： 使用荧光标记探针或在检测阶段产生荧光信号。优点是可多重标记（不同颜色探针同时检测多个靶点）、分辨率高、结合共聚焦显微镜可进行三维成像。是当前最主流的ISH技术。
2. 显色原位杂交： 通过酶促反应产生可见的有色沉淀进行检测。优点是可使用普通光学显微镜观察，信号稳定持久，背景相对较低，能与常规组织学染色（如HE）良好结合。适用于需要长期存档的样本或临床病理诊断。
3. 染色体原位杂交： 主要应用于中期或间期染色体，用于基因定位、染色体结构异常（缺失、重复、易位、倒位）检测、拷贝数变异分析等。FISH是染色体分析的金标准。
4. RNA原位杂交： 特异性检测细胞内的RNA（主要是mRNA），直观展示基因的转录活性及其在组织、细胞或亚细胞水平的时空表达模式。对样本处理和实验条件要求更严格（需避免RNA酶降解）。
5. DNA原位杂交： 主要用于检测基因组DNA序列，如特定基因位点、病毒DNA整合位点、染色体分析等。

三、 核心应用领域

1. 基因表达谱研究： 精确定位特定基因mRNA在发育过程中、不同组织类型、不同生理病理状态下的表达位置和丰度，揭示基因功能及其调控机制。
2. 细胞鉴定与分化研究： 通过特定标志基因的RNA表达，识别和定位特定细胞类型及其在组织器官中的分布。
3. 染色体分析与细胞遗传学：
   • 检测染色体数目异常（非整倍体）。
   • 识别染色体结构畸变（缺失、重复、易位、倒位）。
   • 基因定位（物理图谱）。
   • 间期细胞遗传学诊断（无需细胞培养至中期）。
4. 病原体检测： 在组织样本中直接定位病毒、细菌等病原体的特异性核酸，用于感染性疾病的病理诊断和研究。
5. 肿瘤研究与诊断：
   • 检测癌基因、抑癌基因的扩增、缺失或重排。
   • 监测微小残留病灶。
   • HER2基因扩增状态检测（乳腺癌靶向治疗指导）是临床应用的经典范例。
6. 神经科学研究： 研究神经递质、受体、离子通道等基因在中枢神经系统的表达定位。
7. 发育生物学： 追踪发育调控基因在胚胎不同时期和部位的动态表达，理解形态发生的分子基础。

四、 技术优势与局限

• 优势：
  • 空间定位精准： 在完整的细胞和组织环境中直接显示核酸的位置信息，是其最大的优势。
  • 高特异性： 基于碱基互补配对，特异性强。
  • 灵敏度较高： 尤其是使用信号放大系统的非放射性方法。
  • 形态学关联： 可将分子信息与组织细胞形态学结构直接关联。
  • 多样性： 可检测DNA和RNA，有多种标记和检测策略可选。
• 局限：
  • 技术复杂性： 步骤繁多，实验条件（特别是杂交和洗脱的严谨度）优化要求高，易受多种因素影响。
  • 定量能力有限： 虽然可相对比较信号强弱，但精确定量通常不及PCR或测序技术。
  • 灵敏度限制： 对于极低丰度的靶分子可能难以检测。
  • 样本要求： 需要妥善保存的组织或细胞样本，RNA检测需格外注意避免RNA酶降解。
  • 探针设计与合成成本： 特异性探针的设计与合成（特别是长的、修饰的探针）可能成本较高。

五、 近年进展与未来方向

1. 信号放大技术： 如酪胺信号放大技术显著提高了非放射性ISH（尤其是CISH）的灵敏度。
2. 多重FISH： 通过组合不同荧光染料标记的多种探针，实现在单个样本中同时检测多个靶标（mFISH, SKY）。结合光谱成像的成像FISH能区分更多颜色。
3. 高分辨率与超分辨率FISH： 结合特殊探针设计（如寡核苷酸池）和超分辨率显微技术（STORM, STED），分辨率可达几十纳米，可研究染色质三维结构、单分子RNA定位。
4. 空间转录组学： 结合高通量测序与组织原位捕获技术，在保留空间位置信息的同时，获取整个转录组表达图谱。虽然不完全等同于传统ISH，但代表了空间组学的重要发展方向。
5. 活细胞FISH： 使用荧光标记的核酸适配体或特殊设计的探针，尝试在活细胞中进行动态观测RNA，技术仍在发展中。
6. 自动化与标准化： 仪器平台的自动化操作有助于提高实验效率和结果一致性，利于临床转化。

六、 质量控制关键点

• 探针质量： 特异性、浓度、标记效率。
• 样本质量： 固定及时有效，RNA样本需无RNA酶污染，切片厚度适宜。
• 杂交条件优化： 温度、盐浓度、甲酰胺浓度、探针浓度、时间。
• 严谨性洗脱： 去除非特异性结合的关键步骤。
• 对照设置：
  • 阳性对照： 已知表达靶分子的样本。
  • 阴性对照：
    • 不加探针或使用无关联探针。
    • 用RNA酶处理样本（针对RNA ISH）。
    • 使用竞争性抑制（过量未标记探针）。
  • 内参对照： 如看家基因的RNA或组成型表达的DNA序列。
• 信号强度与背景： 平衡特异信号强度和背景噪音。

结论：

原位杂交技术在生命科学和医学研究中扮演着不可替代的角色，它独特的空间定位能力为理解基因功能、细胞类型、发育过程、疾病机制提供了直观的证据。随着荧光标记、信号放大、显微成像和高通量技术的飞速发展，原位杂交的分辨率、灵敏度、多重检测能力和应用范围不断拓展。尽管面临技术复杂性和定量挑战，其在基础研究、临床诊断（尤其在肿瘤和遗传病领域）中的核心价值依然稳固，并持续推动着空间组学等前沿领域的发展。精心优化实验方案和严格的质量控制是获得可靠、有意义结果的关键。