免疫组化与免疫荧光：揭示组织与细胞奥秘的核心技术
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）和免疫荧光（Immunofluorescence, IF）是现代生物医学研究中不可或缺的技术，尤其在病理诊断、基础研究和药物开发中广泛应用。它们共享“抗原-抗体特异性结合”的核心原理，但通过不同的信号检测方式揭示目标分子在组织或细胞中的定位、表达丰度及分布情况。
一、 基本原理：抗原-抗体的特异性识别
- 抗原（Antigen）： 待检测的目标分子（如蛋白质、多肽、病原体组分等）。
- 抗体（Antibody）： 能与特定抗原发生高亲和力、高特异性结合的免疫球蛋白分子。分为：
- 一抗（Primary Antibody）： 直接识别并结合目标抗原。
- 二抗（Secondary Antibody）： 识别并结合一抗的恒定区（Fc段），本身带有可检测的标记物（如酶或荧光基团）。
二、 免疫组化（IHC）
- 原理： 利用酶标记的二抗（常用辣根过氧化物酶-HRP或碱性磷酸酶-AP）结合一抗-抗原复合物。加入相应的显色底物（如DAB产生棕色沉淀，AEC产生红色沉淀）后，酶催化底物反应生成不溶性有色产物，沉积在抗原所在位置，可在普通光学显微镜下观察。
- 关键步骤：
- 样本制备： 组织固定（常用多聚甲醛）、脱水、包埋（石蜡或冷冻）、切片、贴片。
- 抗原修复： 解除因固定造成的抗原表位遮蔽（常用热诱导修复HIER或酶消化修复）。
- 封闭： 使用血清蛋白等封闭非特异性结合位点，减少背景。
- 一抗孵育： 特异性识别目标抗原。
- 二抗（酶标）孵育： 识别一抗。
- 显色反应： 加入酶底物（如HRP-DAB），产生有色沉淀。
- 复染： 用苏木精（Hematoxylin）等染料染细胞核，提供组织形态学背景。
- 封片： 使用树脂封固剂封片。
- 优点：
- 形态关联性好： 显色产物稳定，可在普通光学显微镜下清晰观察染色结果与组织/细胞形态结构的对应关系。
- 长期保存： 染色玻片可长期保存（避光干燥环境下）。
- 兼容性强： 可与常规H&E染色结合分析，广泛用于组织芯片分析。
- 仪器普及： 普通光学显微镜即可观察。
- 缺点：
- 单色检测： 主要用于单靶标或多靶标顺序检测（需洗脱上一轮染色），同时多重标记能力有限。
- 分辨率限制： 光学显微镜分辨率限制了亚细胞结构的精确定位。
- 信号放大有限： 信号强度依赖于酶促反应和显色沉淀的积累。
- 典型应用： 病理诊断（癌症分型、预后标志物检测、病原体检测），蛋白在组织中的定位与表达水平研究。
三、 免疫荧光（IF）
- 原理： 利用荧光素（Fluorophore）标记的二抗（如FITC-绿光， TRITC/ Cy3-橙红光， Cy5-远红光， Alexa Fluor系列）结合一抗-抗原复合物。在特定波长的激发光照射下，荧光素发射出波长更长的荧光，通过荧光显微镜进行观察和成像。
- 关键步骤：
- 样本制备： 与IHC类似，但冷冻切片更常用，细胞培养物（细胞爬片/涂片）也广泛应用。固定需考虑荧光兼容性。
- 抗原修复： 类似IHC。
- 封闭： 类似IHC。
- 一抗孵育： 识别目标抗原。
- 二抗（荧光标记）孵育： 识别一抗并携带荧光基团。
- 复染： 常用DAPI染细胞核（发出蓝色荧光）。
- 封片： 使用抗荧光淬灭封片剂（含防淬灭剂），减缓荧光衰减。
- 成像： 在荧光显微镜（宽场、共聚焦、转盘共聚焦等）下观察和采集图像。
- 优点：
- 多重标记： 可使用不同荧光标记的二抗同时检测多个不同靶标（需一抗种属来源不同且荧光光谱不重叠）。
- 高分辨率与灵敏度： 尤其是激光共聚焦显微镜（Confocal），可提供光学切片和亚细胞精确定位信息，灵敏度通常优于IHC。
- 信号定量潜力： 荧光信号的强度理论上可进行定量或半定量分析（需严格控制实验条件）。
- 缺点：
- 荧光淬灭： 荧光信号会随时间衰减，需尽快成像，保存条件要求高。
- 自发荧光干扰： 某些组织成分（如红细胞、脂褐素）本身具有自发荧光，可能干扰结果。
- 仪器成本高： 高质量的荧光显微镜（尤其是共聚焦）价格昂贵。
- 形态学关联稍弱： 荧光图像的组织背景形态不如IHC在明场下清晰。
- 典型应用： 亚细胞结构定位研究（如蛋白共定位分析），活细胞/固定细胞表面或胞内蛋白检测，多重靶标同时检测，高分辨率成像研究。
四、 核心技术要点与优化策略
- 抗体选择与验证： 抗体的特异性、灵敏度、适用种属及样本类型（冰冻/石蜡切片、细胞）至关重要。严格设立阴性和阳性对照（组织对照、替代对照-不加一抗、吸收对照等）是结果可靠性的基石。
- 样本处理： 适当的固定（充分交联抗原但不过度遮蔽）、标准化包埋/切片厚度、优化的抗原修复条件是保留抗原性和形态的关键。
- 封闭与洗涤： 有效封闭（如血清、BSA、脱脂奶粉）和充分的洗涤（缓冲液如PBS/TBS，含吐温等去垢剂）能最大限度降低非特异性背景。
- 浓度与孵育： 优化抗体稀释度（避免高浓度导致非特异结合或低浓度导致信号弱）、孵育时间（通常4°C过夜或室温1-2小时）和温度。
- 信号检测系统： IHC需优化显色系统（酶/底物组合）、显色时间（避免过显色）。IF需选择合适滤光片组（匹配荧光素的激发/发射光谱）、优化激光强度和增益设置，避免信号过曝或淬灭。
- 复染与封片： 选择合适的复染（苏木精/DAPI）以定位结构。IF务必使用抗淬灭封片剂。
五、 选择IHC还是IF？
六、 总结
免疫组化和免疫荧光是强大的分子定位工具，它们利用抗体探针精准地“点亮”组织或细胞中的目标分子。IHC以其优异的形态学关联性和便利性，成为病理诊断和研究的主流技术。IF则在多重检测能力、灵敏度和分辨率上更胜一筹，尤其适合精细的亚细胞定位和共定位研究。选择哪种技术取决于具体的研究目标（如是否需要多重标记、分辨率要求、定量需求、样本类型及可用设备）。深刻理解两者的原理、优势、局限和关键实验步骤，是获得可靠、可重复结果的根本保障。
应用案例举例：
- IHC： 在乳腺癌活检组织中检测雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达状态，指导临床分型和治疗决策。
- IF： 使用抗微管蛋白（标记微管网络，绿色荧光）、抗线粒体蛋白（标记线粒体，红色荧光）和DAPI（标记细胞核，蓝色荧光）三重染色，在共聚焦显微镜下清晰展现细胞骨架、能量工厂和遗传物质的三维空间关系。
这两种技术相互补充，共同推动着生命科学研究和临床病理诊断的不断进步。