细胞转染及稳定表达细

细胞转染及稳定表达细胞系构建指南

细胞转染是将外源核酸（DNA或RNA）导入真核细胞的关键技术，广泛应用于基因功能研究、蛋白质表达、基因治疗和药物筛选等领域。构建稳定表达外源基因的细胞系，更是药物筛选、蛋白生产等长期研究的基石。

一、细胞转染基础

1. 目的与意义：

   • 瞬时转染： 外源DNA存在于细胞质或细胞核中，不整合到宿主基因组，表达时间短（通常24-96小时）。适用于快速检测基因功能、启动子活性、RNA干扰等。
   • 稳定转染： 外源DNA整合到宿主细胞基因组中，随细胞分裂稳定遗传并持续表达。需经过筛选和克隆化过程，用于长期研究或生产重组蛋白。

2. 主要转染方法：

   • 化学法：
     • 阳离子脂质体法： 最常用。带正电的脂质与带负电的核酸形成复合物，通过细胞膜融合或内吞进入细胞。操作简便、适用细胞广、效率较高。
     • 阳离子聚合物法（如聚乙烯亚胺）： 原理类似脂质体，成本较低，适用多种细胞系，但可能毒性稍高。
     • 磷酸钙共沉淀法： 较经典，利用核酸与钙离子形成的沉淀颗粒附着于细胞表面被内吞。成本低，但条件较难优化，重复性不稳定。
   • 物理法：
     • 电穿孔法： 利用高压电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔洞，使核酸进入。效率高，适用于难转染的原代细胞、悬浮细胞等，但需优化电击参数，可能导致细胞损伤。
     • 显微注射： 直接将核酸注入单个细胞核或细胞质。效率最高且精确，但技术难度大、通量低，主要用于胚胎操作或特定研究。
   • 病毒载体法： 利用改造的病毒（慢病毒、逆转录病毒、腺病毒等）高效感染细胞并传递基因。
     • 慢病毒/逆转录病毒： 可整合入宿主基因组，用于建立稳定表达系，尤其适用于难转染的细胞或体内研究。
     • 腺病毒/腺相关病毒： 通常不整合，瞬时表达效率极高，适合体外/体内短期高表达研究。

二、构建稳定表达细胞系的核心步骤

1. 选择合适的表达载体：

   • 含有目标基因的表达框（强启动子、多克隆位点）。
   • 含有筛选标记基因： 这是稳定转染的核心。常用：
     • 抗生素抗性基因： 如新霉素抗性（NeoR/G418）、嘌呤霉素抗性（PuroR）。细胞需在含相应抗生素的培养基中生长筛选。
     • 代谢筛选基因： 如潮霉素B抗性（HygR）、杀稻瘟菌素S抗性（BsdR）。
   • 其它元件：起点（用于质粒扩增）、多腺苷酸化信号等。
   • 注意：病毒载体本身已整合筛选元件。

2. 细胞准备与转染：

   • 细胞处于对数生长期，状态良好。
   • 根据所选方法（如脂质体法、电穿孔法）进行转染操作，优化转染条件（核酸剂量、比例、时间等）。
   • 设置适当的对照组。

3. 筛选压力施加（抗生素筛选）：

   • 预实验确定致死浓度： 对未转染的野生型细胞进行抗生素毒性测试，找到100%杀死所有细胞的最低有效浓度。
   • 正式筛选：
     • 转染后24-48小时（让细胞恢复并开始表达筛选标记），更换含致死浓度抗生素的新鲜培养基。
     • 持续筛选： 每2-3天更换含抗生素的培养基，持续10-14天或更久。期间大量未成功整合外源基因的细胞会死亡脱落。
     • 终点： 当显微镜下观察到耐药细胞形成明显的“小岛”状克隆群落时，筛选基本完成。

4. 单克隆化（克隆形成）：

   • 目的： 确保最终获得的稳定细胞系来源于单个转染成功的祖细胞，保证基因型与表型的均一性。
   • 常用方法：
     • 有限稀释法：
       • 将抗生素筛选后的混合细胞（可能含有多个不同克隆）消化成单细胞悬液，精确计数。
       • 将细胞稀释至极低密度（如每个孔0.5-1个细胞），接种到96孔板中。
       • 在含抗生素的培养基中培养，定期观察记录。
       • 标记仅含单个克隆的孔（通常来自单个细胞增殖形成）。
     • 克隆环/克隆盘法： 在培养皿中筛选出物理隔离的单个克隆，用无菌环或盘取出，再分散接种到新孔中培养。
     • 流式细胞分选法： 若外源基因表达荧光蛋白（如GFP），可使用流式细胞仪直接分选出单个阳性细胞到96孔板中。

5. 单克隆培养与扩增：

   • 挑取的单个克隆在含抗生素的培养基中继续培养、扩增。
   • 密切观察细胞形态、生长状态。

6. 稳定表达株的鉴定：

   • 表达水平检测：
     • mRNA水平： RT-qPCR。
     • 蛋白水平：
       • 免疫印迹（Western Blot）：检测目标蛋白大小和表达强弱。
       • 免疫荧光/免疫组化：定位目标蛋白在细胞内的分布。
       • 流式细胞术：定量分析荧光蛋白或表面标记的表达。
       • ELISA/功能活性测定：检测分泌表达蛋白的浓度或活性。
   • 基因组整合确认（可选但推荐）： PCR检测外源基因在基因组中的存在。
   • 稳定性验证： 将细胞在无抗生素培养基中传代培养一定代数（如15-20代），定期检测目标蛋白表达水平是否维持稳定。

三、关键注意事项

• 细胞状态： 健康的细胞是转染和筛选成功的前提。避免过度传代或污染。
• 载体设计： 选择强启动子、高效筛选标记至关重要。确保目标基因与筛选标记在同一个载体上或共转染。
• 抗生素筛选：
  • 严格确定致死浓度！ 这是筛选成功与否的关键。
  • 持续施加压力： 确保培养基中抗生素浓度始终有效（药物会降解）。
  • 彻底去除死细胞： 及时换液，防止死细胞碎片影响活细胞生长。
• 单克隆化： 务必确认克隆来源于单个细胞，避免混合克隆。耐心是关键。
• 无菌操作： 整个流程，尤其在单克隆化阶段，严格无菌操作防止污染。
• 冻存备份： 对鉴定好的稳定株及时进行冻存备份，保留低代次细胞。

四、挑战与应对

• 转染效率低： 优化方法（更换试剂/方法）、调整DNA剂量、细胞密度、转染时间。考虑改用病毒载体。
• 筛选后无克隆生长：
  • 确认筛选浓度准确有效。
  • 确认转染效率是否足够（可做瞬时表达检测）。
  • 目标基因/筛选标记毒性过大？尝试诱导表达系统。
  • 细胞状态差或抗生素过期。
• 克隆生长缓慢： 抗生素压力过大？优化浓度。细胞本身增殖慢？耐心等待。
• 表达水平低/不稳定：
  • 载体启动子弱？尝试更换强启动子。
  • 基因沉默？尝试使用抗沉默元件或筛选更高表达克隆。
  • 筛选压力不足？确保抗生素持续有效。
• 均一性问题： 单克隆化不彻底？重新克隆筛选。

五、新技术应用

• CRISPR/Cas辅助整合： 利用CRISPR技术在基因组特定位点（如安全港位点AAVS1）定点整合外源基因，提高整合效率和表达稳定性，减少位置效应。
• 诱导表达系统： 构建受四环素（Tet-On/Off）等小分子调控的稳定株，实现目标基因表达的时空可控。
• 多基因稳定表达： 使用多个不同抗性的载体共转染筛选，或利用双顺反子载体、自剪切多肽等策略。

结论：

稳定表达细胞系的构建是一项系统工程，涉及转染、筛选、单克隆化和鉴定等多个关键环节。成功的关键在于严格的实验设计、细致的操作、关键的参数优化（尤其是致死浓度测定）以及充分的验证。尽管过程耗时（通常需数周到数月），但获得的遗传背景清晰、表达稳定的细胞株，是进行可靠、可重复的生物医学研究的宝贵资源。持续发展的基因编辑和调控技术，为解决传统构建方法中的挑战（如整合位点随机性、表达沉默）提供了更优的解决方案。