外泌体提取

外泌体提取技术与方法指南

外泌体是直径约30-150纳米的细胞外囊泡，携带蛋白质、核酸、脂质等生物活性分子，在细胞间通讯、疾病诊断与治疗中扮演关键角色。其有效提取与纯化是相关研究的基础，以下是主要提取方法：

一、 核心提取方法

1. 超速离心法 (Ultracentrifugation, UC)：

   • 原理： 利用密度与沉降系数差异，通过递增强离心力逐步去除细胞碎片、大囊泡等杂质，最终沉淀外泌体。
   • 流程：
     • 低速离心（如300-2000×g）：去除细胞、大碎片。
     • 中速离心（如10,000-20,000×g）：去除凋亡小体、大囊泡。
     • 超速离心（100,000-200,000×g）： 沉淀外泌体（通常重复1-2次）。
   • 优点： 原理清晰，无需特殊试剂，样本量大时相对经济，被视为“金标准”。
   • 缺点： 耗时长（数小时），设备昂贵，高剪切力可能损伤外泌体，易共沉淀脂蛋白/蛋白聚集体，回收率不稳定。

2. 密度梯度离心法 (Density Gradient Centrifugation)：

   • 原理： 在超速离心前或同时，利用蔗糖/碘克沙醇等介质形成密度梯度，分离不同密度的颗粒。外泌体（密度约1.10-1.19 g/mL）在特定梯度层富集。
   • 流程：
     • 制备线性或阶梯密度梯度溶液。
     • 将样本（或超速离心沉淀物）铺于梯度上层。
     • 超速离心（如100,000-200,000×g）后，收集目标密度层的外泌体。
     • 稀释清洗去除梯度介质。
   • 优点： 纯度显著高于单纯超速离心，能有效分离外泌体与其他密度相近的杂质（如LDL/VLDL）。
   • 缺点： 操作更繁琐耗时，样本处理量减少，回收率可能降低，稀释步骤可能损失外泌体。

3. 基于尺寸的分离法：

   • 尺寸排阻色谱法 (Size Exclusion Chromatography, SEC)：
     • 原理： 样本通过装有多孔填料的层析柱，小分子进入填料孔道而延迟流出，大颗粒（如外泌体）无法进入孔道而先被洗脱。
     • 优点： 操作相对温和，保持外泌体完整性，污染少（尤其蛋白），重现性好，洗脱液兼容下游应用。
     • 缺点： 样本体积受限，稀释作用需浓缩，部分填料可能产生非特异性吸附。
   • 超滤法 (Ultrafiltration)：
     • 原理： 利用特定孔径（如100kDa, 300kDa）的滤膜截留大于孔径的外泌体。
     • 优点： 快速简单，成本相对低。
     • 缺点： 膜易堵塞，剪切力可能损伤外泌体，非特异性吸附导致回收率低，纯度不高（与杂质共滞留）。

4. 基于聚合物沉淀法 (Polymer-based Precipitation)：

   • 原理： 加入聚乙二醇（PEG）等高分子聚合物，改变溶液环境，降低外泌体溶解度使其沉淀。
   • 优点： 操作极其简单快速，无需昂贵设备，样本处理量灵活。
   • 缺点： 纯度最低，大量共沉淀杂质（蛋白质、聚合物本身），聚合物干扰下游分析（如质谱、测序），需严格清洗（影响回收率），重现性有时不佳。

5. 基于免疫亲和捕获法 (Immunoaffinity Capture)：

   • 原理： 利用包被在固相载体（磁珠、板、柱）上的抗体（如抗CD9, CD63, CD81, EpCAM等），特异性结合外泌体表面抗原。
   • 优点： 特异性最高，可获得特定细胞来源或携带特定标志物的外泌体亚群。
   • 缺点： 成本高（抗体价格），可能漏掉不表达目标抗原的外泌体，洗脱条件（如低pH）可能损伤外泌体或影响下游分析，样本通量通常较低。

二、 选择方法与优化要点

• 研究目的：
  • 要求高纯度（如蛋白组学/核酸组学）：密度梯度离心、SEC优先。
  • 要求高特异性（亚群研究）：免疫亲和捕获。
  • 要求快速简便/样本量大：聚合物沉淀（需接受低纯度）、超滤。
  • “金标准”参照：超速离心（常结合密度梯度）。
• 样本类型： 不同体液（血浆、血清、尿液、脑脊液等）成分差异大。
  • 血浆/血清：脂蛋白丰富，密度梯度或SEC更利于去除非外泌体杂质。
  • 尿液：THP蛋白易干扰，预处理（如DTT降解THP）可能必要。
• 下游应用：
  • 功能性研究（如细胞摄取）：需高纯度、高活性外泌体，避免杂质干扰。
  • 核酸分析：需避免核酸酶污染（尤其RNA），聚合物沉淀法需彻底去除聚合物干扰。
  • 蛋白分析：需避免高丰度蛋白污染（尤其血清样本），SEC或密度梯度更佳。
• 样本量： 大体积样本（如条件培养基）首选超速离心、超滤或沉淀法。小体积珍贵样本（如临床体液）可选SEC或免疫捕获以提高回收率。
• 时间与成本： 平衡实验周期、设备/试剂成本与结果要求。

三、 质量控制与鉴定

提取的外泌体必须进行表征确认：

• 粒径与浓度： 纳米颗粒追踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）、电阻脉冲传感（TRPS）。
• 形态： 透射电子显微镜（TEM）、冷冻电镜（Cryo-EM）。
• 标志物： Western Blot、流式细胞术检测阳性（如CD9, CD63, CD81, TSG101, Alix）和阴性（如Calnexin, GM130）标志物。
• 纯度： 评估主要污染物（如蛋白浓度、脂蛋白/载脂蛋白含量）。

四、 关键注意事项

• 样本处理： 新鲜样本或妥善冻存（-80°C）。血浆/血清分离需及时，避免反复冻融。避免引入外源性囊泡（如血清培养细胞时用外泌体耗尽的血清）。
• 标准化： 详细记录方案（离心力/时间、缓冲液成分、温度等）以保证可重复性。
• 污染控制： 所有耗材（管、吸头）需无核酸酶/蛋白酶污染。严格无菌操作。
• 缓冲液： 推荐使用含蛋白酶抑制剂的PBS（避免离子螯合剂EDTA影响某些下游应用）。
• 离心管： 超高速离心必须使用耐高G值的专用离心管（如聚碳酸酯）。
• 温度： 多数步骤推荐4°C操作以减少降解。

五、 发展与挑战

当前研究致力于开发更快速、高效、低成本、自动化且适用于多种样本（尤其临床微量样本）的新方法，如微流控技术、声波分离、亲和纯化技术革新等。标准化和质量控制仍是推动外泌体研究可靠性和临床转化的核心挑战。

选择合适的提取方法需综合考量研究目标、样本特性、下游应用及资源限制，并结合严谨的质量验证，才能确保获得可靠的研究结果。