单宁（儿茶素）检测

单宁（及儿茶素）检测：方法与技术要点

一、引言

单宁（Tannins）是一类广泛存在于植物中的水溶性多酚化合物，具有涩味和收敛性。根据化学结构，主要分为水解单宁（如鞣花单宁、没食子单宁）和缩合单宁（又称原花青素）。儿茶素（Catechins）是缩合单宁的基本结构单元和重要前体物质，属于黄烷-3-醇类化合物，常见的有表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）等。

准确检测样品中的单宁总量、缩合单宁含量或特定儿茶素单体含量，在多个领域具有重大意义：

• 食品饮料： 茶叶、红酒、果汁、啤酒的风味、涩感调控、品质评价及货架期研究。
• 农业与植物学： 作物抗病虫害能力研究、果实成熟度判定、品系选育。
• 医药与保健品： 评估植物提取物的抗氧化、抗炎、心血管保护等生物活性潜力。
• 化妆品： 开发具有收敛、抗氧化、防晒功效的天然成分。
• 环境科学： 研究单宁在生态系统中的作用（如抑制微生物活动、影响养分循环）。

二、样品前处理

获得准确结果的前提是有效的样品前处理：

1. 提取： 常用溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、水或其混合物（常含少量酸，如0.1-1%甲酸/乙酸）。提取方式有振荡、超声、索氏提取、微波辅助提取等。选择合适的溶剂和条件对充分释放目标物至关重要。
2. 净化： 复杂样品（如含大量色素、脂质、蛋白质）可能需要净化步骤，常用方法有固相萃取（SPE，如C18柱、聚酰胺柱）、液液萃取。
3. 浓缩/复溶： 提取液常需浓缩（如旋转蒸发、氮吹）后，用适合分析的溶剂（如初始流动相）复溶定容。
4. 过滤： 上机前需经微孔滤膜（如0.22或0.45 µm）过滤，去除颗粒物。

三、主要检测方法

检测方法的选择取决于目标化合物（总单宁、缩合单宁、单体儿茶素）、所需灵敏度、精确度及样品复杂性。

1. 总酚含量测定（常作为单宁含量的间接指标）：

   • Folin-Ciocalteu法： 最常用方法。原理是样品中的酚类物质还原磷钼钨酸试剂，在特定波长（通常760nm左右）下产生蓝色络合物，其吸光度与总酚含量成正比。结果常以没食子酸当量（GAE）表示。该法操作简便、成本低，但特异性不高，对所有酚类均有响应。

2. 总单宁含量测定：

   • 皮粉法（Hide Powder Method）： 经典方法。利用皮粉（胶原蛋白）选择性吸附单宁的原理，通过吸附前后提取液总酚含量的差值计算单单宁含量（以没食子酸单宁或儿茶素当量表示）。操作较繁琐耗时，但特异性相对较好。
   • 沉淀法（如BSA法）： 利用单宁能与蛋白质（如牛血清白蛋白BSA）形成不溶性复合物的特性，通过测定沉淀物重量或溶解沉淀后测含量来计算单宁量。特异性较好。
   • 特异性显色法：
     • 香草醛-盐酸法： 主要用于检测缩合单宁（黄烷-3-醇类）。在酸性条件下，香草醛与缩合单宁的间苯三酚A环反应生成红色产物，在500nm处测定。结果常以儿茶素当量（CE）表示。操作简便，对缩合单宁有较好特异性。
     • 原花色素（Proanthocyanidin）测定法（如DMAC法）： 常用4-二甲氨基肉桂醛（DMAC）作为显色剂，在酸性醇溶液中与黄烷-3-醇单元反应生成蓝色化合物，在640nm左右检测。对单体儿茶素和低聚原花青素响应较强，特异性优于香草醛法。

3. 单体儿茶素和特定单宁组分测定（高分离度方法）：

   • 高效液相色谱法（HPLC）： 最常用且主流的方法。
     • 原理： 基于化合物在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
     • 分离： 主要使用反相C18色谱柱。流动相通常为含水溶剂（含酸如甲酸、乙酸、磷酸）和有机溶剂（乙腈、甲醇）的梯度洗脱系统。
     • 检测：
       • 紫外/可见光检测器（UV-Vis）： 儿茶素和单宁在200-280nm有强吸收（苯环结构），是最常用的检测方式。不同单体有其特征吸收波长。
       • 二极管阵列检测器（DAD/PDA）： 可同时获得多个波长的吸收信号和光谱信息，有助于峰鉴定和纯度验证。
       • 荧光检测器（FLD）： 部分儿茶素具有天然荧光（或在衍生化后），FLD能提供更高的选择性（激发波长~276nm，发射波长~316nm）和灵敏度（尤其对EC和EGC）。
     • 优点： 分离效果好，可同时定量多种单体儿茶素（如C, EC, EGC, EGCG, ECG等）和一些低聚缩合单宁，精度高，自动化程度高。
   • 超高效液相色谱法（UPLC/UHPLC）： HPLC的升级版。使用更小粒径（<2µm）的色谱柱和更高压力系统，显著提高分离速度、分辨率和灵敏度，减少溶剂消耗。
   • 液相色谱-质谱联用法（LC-MS, LC-MS/MS）：
     • 原理： 液相色谱分离后，进入质谱进行离子化和质量分析。
     • 优势：
       • 强大的定性能力： 通过精确分子量和特征碎片离子提供化合物结构信息，是确证目标化合物（特别是复杂样品中痕量成分或未知物）的金标准。
       • 高灵敏度和高选择性： 多反应监测（MRM）模式可有效排除基质干扰，检测限极低。
       • 无需完全基线分离： 依靠质荷比（m/z）区分共洗脱物。
     • 应用： 特别适用于复杂基质（如生物体液、组织）中痕量儿茶素/单宁代谢物的分析、未知单宁聚合物的结构解析。
   • 毛细管电泳法（CE）： 基于化合物在电场中的迁移速率差异进行分离。有时用于分离儿茶素单体，具有高分离效率、低样品和溶剂用量等优点，但重现性和灵敏度有时不及液相色谱法。

4. 其他方法：

   • 近红外光谱法（NIRS）： 基于化合物分子键振动的倍频与合频吸收。需建立稳健的校正模型，适用于大批量样品的快速筛查和现场/在线检测（如茶叶分级），但精度通常低于色谱法。
   • 电化学传感器： 利用儿茶素/单宁的易氧化特性开发传感器。研究热点，可能用于快速检测，但稳定性和普适性仍需提高。

四、结果计算与表达

• 标准曲线法： 最常用。使用相应的标准品（如没食子酸用于总酚/水解单宁，儿茶素用于缩合单宁或单体分析）配制系列浓度溶液，建立浓度与响应值（吸光度、峰面积/峰高）的标准曲线。根据样品的响应值代入曲线计算浓度。
• 定量单位： 结果常用以下单位表示：
  • 质量浓度：如 µg/ml, mg/L, g/L
  • 质量分数：如 mg/g干重或鲜重, % (w/w)
  • 当量浓度：如 mmol/L GAE (总酚), mmol/L CE (缩合单宁)
• 报告内容： 应清楚说明检测的具体目标物（如总酚、总单宁、缩合单宁、特定单体儿茶素）、所采用的方法、使用的标准品及表达单位。

五、方法选择与质量控制要点

• 目标决定方法：
  • 快速筛查总酚/单宁： Folin-Ciocalteu法、香草醛法、DMAC法、NIRS。
  • 精确测定单体儿茶素和低聚单宁： HPLC/UHPLC (UV/DAD/FLD)。
  • 痕量组分分析、复杂基质或结构鉴定： LC-MS(/MS)。
• 关键质量控制措施：
  • 标准品： 使用高纯度、有证书的分析标准品。
  • 标准曲线： 覆盖样品预期浓度范围，线性良好（R² > 0.995），定期验证。
  • 空白与对照： 包含溶剂空白、方法空白（加标空白基质）和阴性对照。
  • 精密度： 进行重复性（同一样品多次测定）和重现性（不同批次/人员/日期测定）试验。
  • 准确性： 进行加标回收率实验（建议回收率在80-120%区间）。
  • 检测限（LOD）/定量限（LOQ）： 评估方法的灵敏度。
  • 系统适用性试验（色谱法）： 测试色谱柱分离度、理论塔板数、拖尾因子等。
  • 样品稳定性： 考察样品在制备和储存过程中的稳定性。

六、结论

单宁（特别是儿茶素）的检测是多个学科研究和产业质量控制的核心环节。从经典的Folin法和特异性显色法，到主流的HPLC/UHPLC分离技术，再到高端的LC-MS/MS确证方法，形成了多层次的分析技术体系。选择合适的方法需要考虑检测目标物的性质、所需信息的精细程度、样品复杂性以及资源和时间成本。无论采用何种方法，严格的质量控制是获得可靠数据的基石。随着技术的不断发展，更快速、更灵敏、更精准、更自动化的检测手段将持续推动该领域的进步。