多糖分子量分布测定

发布时间：2025-06-16 08:53:32 阅读量：3 作者：生物检测中心

多糖分子量分布测定技术与方法

引言：分子量分布的核心意义 多糖的生物活性（如免疫调节、抗肿瘤）和理化性质（溶解性、粘度、流变性）与其分子量大小及分布范围密切相关。精确测定分子量分布是多糖结构表征、构效关系研究、生产工艺优化及质量控制的关键环节。

一、核心测定原理 分子量分布测定本质是将多糖混合物按分子尺寸差异进行分离，并定量测定各组分含量：

  1. 体积排阻原理 (Steric Exclusion)： 多孔填料依据多糖流体力学体积分离不同分子量的组分。
  2. 光散射原理： 直接测定溶液中分子的绝对分子量（无需标准品）。
  3. 粘度检测原理： 测定特性粘度，结合光散射数据推演分子构象。
  4. 浓度检测原理（示差折光/紫外）： 定量测定各组分的浓度。

二、主要测定方法

  1. 凝胶渗透色谱法 / 尺寸排阻色谱法 (GPC/SEC) - 常用金标准

    • 原理： 基于体积排阻效应，样品随流动相流经多孔凝胶色谱柱。
    • 分离过程： 大分子无法进入填料孔穴，先流出色谱柱；小分子进入孔穴，滞留时间长，后流出。
    • 检测器联用：
      • 示差折光检测器 (RID)： 通用型浓度检测器。
      • 多角度激光光散射检测器 (MALS)： 直接测定每个洗脱组分的绝对重均分子量 (Mw)。
      • 粘度检测器 (Viscometer)： 测定特性粘度。
    • 特点： 分离效率高、重复性好，与多种检测器联用可获取多维分子信息（分子量、分子尺寸、构象）。

  2. 场流分离法 (FFF) - 超宽范围分离优势

    • 原理 (以AF4为主)： 在扁平通道内施加垂直流动方向的场力（如交叉流），依据分子扩散系数差异进行分离。
    • 分离过程： 小分子扩散快，靠近通道中心层，流速快先流出；大分子靠近累积壁，流速慢后流出。
    • 特点： 分离范围极宽（Da至微米级），适用于超大分子量、易团聚或形状复杂的多糖样品，常联用MALS/RID。

  3. 其他辅助或经典方法

    • 超速离心法： 基于沉降速率测定分子量分布，是经典方法，但操作复杂耗时。
    • 质谱法 (MS)： 如MALDI-TOF MS适用于分子量较小（<100 kDa）、分布较窄多糖的精确测定。
    • 特性粘度法： 测量溶液粘度变化估算平均分子量，简便但只能获取粘均分子量 (Mv)，无法获得分布信息。
    • 渗透压法、端基分析法： 主要用于测定数均分子量 (Mn)，应用较少。

三、数据处理与分子量参数计算

  1. 标准品校正法 (需已知分子量标准品)：
    • 使用结构相似的窄分布标准品（如葡聚糖、支链淀粉）绘制Log(M)-Ve校准曲线。
    • 根据样品洗脱体积Ve，从校准曲线查得分子量。
    • 输出：分子量分布曲线、数均分子量 (Mn)、重均分子量 (Mw)、峰值分子量 (Mp)、多分散系数 (PDI=Mw/Mn)。
  2. 绝对分子量测定法 (光散射法为主)：
    • MALS基本原理： 测量散射光强角度分布，通过Debye图拟合得到绝对Mw及均方根旋转半径 (Rg)。
    • 联用SEC/GPC或FFF： 在浓度检测器信号基础上，每个洗脱点实时计算Mw。
    • 三联检测 (SEC-MALS-RID-Vis)： 结合光散射、浓度和粘度信号，可同时计算绝对Mw、Rg、特性粘度及Mark-Houwink参数。
    • 输出： 无需标准品即可获得绝对分子量分布及多种构象参数。

四、实验关键影响因素与注意事项

  1. 溶剂选择： 溶剂必须充分溶解多糖，避免聚集。常用溶剂包括缓冲盐溶液、水、DMSO、DMF/LiBr等。
  2. 色谱柱选择： 填料孔径范围需匹配目标多糖分子量范围。
  3. 流动相条件： 优化流速、温度。常需添加适量盐（如NaNO₃）抑制静电作用。
  4. 样品制备：
    • 完全溶解，必要时加热或超声辅助。
    • 精确浓度（优化信噪比）。
    • 充分过滤去除杂质或未溶物。
  5. 标准品适用性： 校准法要求标准品与样品结构、构象相似，否则误差大。
  6. 浓度效应： 高浓度可能导致色谱异常峰形及分子量测定偏差。
  7. 聚集问题： 多糖易形成聚集体，需确保测试条件下样品为真实分子分散状态。

五、方法选择与应用建议

  • 常规分析、质量控制： SEC/GPC-RID（标准品校准法）简便快速。
  • 精确分子量及分布、构象研究： SEC/GPC-MALS-RID或SEC-MALS-RID-Vis是首选。
  • 超大分子量、超宽分布或复杂样品分离： AF4-MALS-RID具有显著优势。
  • 小分子量精确测定： MALDI-TOF MS可能更适合。
  • 未知结构样品： 优先选择绝对分子量测定法（MALS）。

六、最新发展与展望

  1. 更高分离能力： 新型色谱柱和高分辨率FFF技术提升分离效能。
  2. 多维联用技术： 如SEC/AF4-MALS-RID-Vis提供更全面的分子特征信息。
  3. 数据处理智能化： 先进算法提升复杂分布数据的解析精度和效率。
  4. 原位/在线检测： 发展更灵敏、兼容性更强的检测器。

结论 多糖分子量分布测定是连接其结构与功能的桥梁。凝胶渗透色谱/尺寸排阻色谱联用多角度激光光散射检测器已成为获取绝对分子量分布信息的强大主流技术。场流分离则为超大分子量或复杂多糖体系提供了独特解决方案。深刻理解各方法原理、严谨优化实验条件并结合样品性质选择合适技术，是获取准确可靠分子量分布数据的关键。该领域的持续发展将为深入挖掘多糖的生物活性与开发新型功能材料提供更强大的分析支撑。