淀粉分子量分布测定：原理、方法与意义
淀粉作为重要的天然高分子多糖，其分子量及其分布直接影响糊化、流变、成膜等加工与应用性能。精确测定淀粉分子量分布是理解其结构-性能关系的关键。
一、 核心测定原理
淀粉分子量分布测定主要基于尺寸排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography, SEC），也称为凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography, GPC）：
- 分离基础： 色谱柱内填充特定孔径的多孔凝胶填料。淀粉分子在流动相（溶剂）携带下流经色谱柱。
- 按尺寸分离： 较大的淀粉分子无法进入填料孔洞，在颗粒间隙快速流动，较早流出色谱柱。较小的分子可不同程度地进入孔洞，路径更长，流出色谱柱较晚。
- 检测与记录： 流出色谱柱的淀粉分子被检测器（常用示差折光检测器RI或多角度激光光散射检测器MALLS）检测，产生色谱图（流出时间/体积 vs. 响应信号）。
- 校准与计算：
- 标准品校准法： 使用已知分子量的窄分布多糖标准品（如葡聚糖、支链淀粉标准）绘制“分子量-流出时间”标准曲线。通过样品流出时间查询曲线得到分子量。
- 普适校准法： 使用特性粘度（通过在线粘度计测定）和流出体积，结合Mark-Houwink方程计算分子量，对分子结构差异更普适。
- 光散射联用法（SEC-MALLS/RI）： MALLS直接测定洗脱液中分子的绝对分子量和均方根旋转半径，无需依赖标准曲线，结果最准确，尤其适用于支链淀粉。
二、 关键测定步骤
- 样品前处理（溶解）： 是成功关键。淀粉需完全溶解并解聚成分子状态。常用方法：
- 加热溶解： 在90%以上二甲亚砜（DMSO）或特定缓冲液（如含50mM NaNO₃的0.5M NaOH溶液）中高温（如90-100°C）加热1-2小时，剧烈搅拌或振荡。
- 超声辅助： 辅助溶解过程。
- 酶解辅助（选择性）： 对高支化淀粉，可先用脱支酶（如普鲁兰酶、异淀粉酶）处理，再溶解线性分子和短支链。
- 溶液过滤： 溶解后的样品需经微孔滤膜（常用0.45µm或0.22µm孔径）过滤，去除未溶杂质和颗粒，防止堵塞色谱柱。
- 色谱系统设置：
- 色谱柱： 选择孔径范围合适的凝胶过滤色谱柱组合（通常两根串联），适宜分离高分子量葡聚糖/淀粉。
- 流动相： 一般与溶解溶剂一致，常用含盐（如LiBr、NaNO₃）的DMSO溶液或碱性缓冲液（如含50mM NaNO₃的0.1M NaOH溶液），确保淀粉溶解稳定性及抑制分子聚集。
- 流速： 通常在0.5-1.0 mL/min。
- 柱温： 维持恒定（如60-80°C），保证溶解状态和重现性。
- 检测：
- 示差折光检测器（RI）： 通用型，响应与浓度成正比。
- 多角度激光光散射检测器（MALLS）： 直接测定绝对分子量。
- 在线粘度检测器： 测定特性粘度，用于普适校准。
- 数据处理：
- 标准曲线法： 色谱软件将样品色谱峰保留时间与标准曲线对比，计算各点的分子量(M)，绘制微分/积分分子量分布图。
- 光散射法： 软件结合RI浓度和MALLS光强信号，自动计算每个洗脱体积点的绝对分子量和分布。
三、 重要结果参数
- 数均分子量 (Mn)： 所有分子总质量除以分子总数，对小分子敏感。
- 重均分子量 (Mw)：
<∑(Ni * Mi²)> / <∑(Ni * Mi)>，对大分子敏感。 - 分散度/多分散指数 (Ð)： Mw / Mn。值越接近1，分子量分布越窄；值越大，分布越宽。
- Z均分子量 (Mz)：
<∑(Ni * Mi³)> / <∑(Ni * Mi²)>，对高分子量尾端极度敏感。 - 分子量分布曲线： 微分分布图显示不同分子量的相对含量；积分分布图显示累积分子量分布。
四、 影响测定准确性的关键因素
- 完全溶解： 溶解不全是最大误差来源。
- 抑制聚集： 高温、合适溶剂和流动相可减少分子间作用力引起的聚集。
- 柱效与标定准确性： 色谱柱分离分辨率直接影响分布宽度结果准确性。标准品校准法依赖标准品的准确性和结构匹配性。
- 样品降解： 强碱、高温长时间处理可能导致分子链断裂。
- 浓度效应： 进样浓度过高可能导致柱超载或分子间相互作用，影响保留时间。
- 流动相匹配： 样品溶剂与流动相需严格匹配以避免峰形畸变。
- 数据处理： 积分参数（如基线设定）影响计算结果。
五、 应用意义
- 原料特性鉴定： 区分不同来源（玉米、马铃薯、木薯、蜡质玉米等）淀粉的分子量特征。
- 结构与性质研究： 阐明直链淀粉/支链淀粉比例、支链结构（链长分布）与分子量分布的关系；揭示分子量分布对糊化特性、糊液粘度、凝胶强度、成膜性、酶解敏感性等的影响。
- 工艺优化与质量控制： 监测物理、化学或酶法改性（酸解、氧化、交联、酯化、水解等）过程中分子量分布的变化，评估改性效果与产品均一性。
- 新产品开发： 为设计特定功能（如高粘度、成膜性、慢消化性）的淀粉基材料提供分子基础依据。
六、 总结
尺寸排阻色谱法（SEC/GPC）结合先进的检测技术（RI， MALLS， 粘度计）是测定淀粉分子量分布最有效和广泛应用的手段。其核心挑战在于确保淀粉样品在色谱分析过程中保持完全溶解的单分子状态。通过精确控制样品前处理、色谱条件和严谨的数据分析，分子量分布测定为深入理解淀粉的结构复杂性、构效关系以及指导淀粉在食品、造纸、纺织、粘合剂、生物材料和可降解塑料等领域的应用提供了至关重要的分子水平信息。持续改进溶解方法、发展更高效的分离介质和更精确的绝对定量技术是该领域的重要研究方向。