酵母单/双杂交系统文库构建完整指南
一、 技术原理
- 酵母单杂交 (Y1H):
- 用于研究DNA-蛋白质相互作用。
- “诱饵”(Bait)：目标DNA顺式作用元件（如启动子片段）克隆入报告基因（如 HIS3, LacZ）上游。
- “猎物”(Prey)：待筛的cDNA或基因片段文库，与转录激活域(AD)融合表达。
- 原理：当文库蛋白能与诱饵DNA结合时，募集AD激活下游报告基因表达，使酵母在缺陷培养基生长或显色，从而筛选互作蛋白。
- 酵母双杂交 (Y2H):
- 用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
- “诱饵”(Bait)：目标蛋白与DNA结合域(BD)融合表达。
- “猎物”(Prey)：待筛的cDNA或基因片段文库，与转录激活域(AD)融合表达。
- 原理：当诱饵蛋白与文库蛋白发生相互作用时，BD与AD在空间上靠近，重构功能性转录因子，激活报告基因（如 HIS3, ADE2, LacZ, MEL1）表达，实现筛选。
二、 构建文库所需核心材料
- 载体：
- Y1H:
- 含报告基因及多克隆位点的载体 (用于克隆诱饵DNA)。
- 融合AD的文库表达载体 (用于构建Prey文库)。
- Y2H:
- 融合BD的诱饵表达载体 (用于克隆Bait蛋白)。
- 融合AD的文库表达载体 (用于构建Prey文库)。
- 通用要求： 具有酵母选择标记（如 TRP1, LEU2）、大肠杆菌原点、抗性基因。
- Y1H:
- 宿主菌株：
- Y1H: 报告基因缺失的营养缺陷型酵母菌株 (如Y1HGold系列)。
- Y2H: 报告基因缺失的营养缺陷型酵母菌株 (如Y2HGold系列)，通常含多个报告基因降低假阳性。
- 关键特性： 高效转化效率、低自激活背景、营养缺陷型匹配载体标记。
- 文库来源核酸：
- 目标组织的总RNA或mRNA（高质量、无降解）。
- 或预合成的dsDNA片段（如用于结构域文库）。
- 酶与试剂：
- 反转录酶、RNase抑制剂、DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、核酸外切酶（如用于Gateway克隆）。
- DNA纯化试剂盒。
- 感受态细胞制备试剂（醋酸锂LiAc、载体DNA、PEG）。
- 酵母转化试剂（LiAc/PEG法或电转化试剂）。
- 酵母选择性培养基（SD/-Trp, SD/-Leu, SD/-Trp/-Leu, SD/-His/-Ade等，含适量3-AT抑制背景生长）。
- 耗材与设备：
- 无菌培养皿、锥形瓶、离心管、涂布棒。
- 恒温摇床、培养箱、离心机。
- 电转化仪及电转杯（若用电转化法）。
- 分光光度计、PCR仪、电泳设备。
三、 文库构建详细流程 (以cDNA文库为例)
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高质量RNA制备：
- 使用合适方法（如柱提取法）从目标组织/细胞中提取总RNA。
- 严格防止RNase污染。
- 评估RNA质量：琼脂糖凝胶电泳检测完整性（28S/18S rRNA比率≈2:1）；分光光度计检测纯度（A260/A280 ≈ 2.0， A260/A230 > 2.0）。
- 可选：用Oligo-dT磁珠富集mRNA。
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cDNA合成：
- 第一链合成： mRNA + Oligo-dT引物/随机引物 + 反转录酶 + dNTPs + RNase抑制剂。优化反应条件。
- 第二链合成： 利用RNase H和DNA聚合酶I合成双链cDNA。可加入dUTP（用于后续酶切）。
- 末端修饰： 对cDNA末端进行补平、磷酸化处理，为后续连接做准备（适用于平末端或特定粘末端克隆）。或合成含特定接头序列（如Gateway attB位点）的cDNA。
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cDNA片段化与分级分离（可选但推荐）：
- 目的：去除过短片段、富集中等长度插入片段（通常0.5-2 kb），提高文库蛋白表达效率和多样性。
- 方法：物理剪切（超声）或酶切（如使用识别稀有位点的酶）。
- 琼脂糖凝胶电泳或柱层析分离目标大小范围的片段。回收纯化。
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载体酶切与去磷酸化：
- 根据克隆策略（如同源重组、Gateway、限制酶切-连接），对文库表达载体（AD载体）进行相应处理。
- 限制酶切-连接法： 用合适的限制酶线性化载体。常进行去磷酸化处理（碱性磷酸酶）防止载体自连，降低空载背景。
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连接反应：
- 将处理好的cDNA片段与线性化载体按最佳比例混合。
- 加入T4 DNA连接酶，在合适温度（通常16°C）连接足够时间（如过夜）。
- 优化插入片段与载体的摩尔比（通常3:1到10:1）以获得高连接效率。
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连接产物转化入细菌感受态细胞（初级文库扩增）：
- 将连接产物转化入高效感受态细菌细胞（如大肠杆菌）。
- 目的：大量扩增文库质粒DNA，获得足够量用于酵母转化。
- 计算初级库容：统计转化的菌落数量。理想库容应远大于目标基因的复杂度（通常要求 > 1x10⁶ CFU）。
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质粒文库提取与定量：
- 收集所有转化菌落进行质粒大量提取。
- 测定质粒DNA浓度和纯度。
- 可选质量控制： 随机挑取少量菌落（如20-50个），提取质粒进行PCR或酶切鉴定，估算插入片段阳性率（应 > 80%）和平均大小。
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酵母感受态细胞制备：
- 使用目标酵母菌株（如Y2HGold用于双杂）在合适培养基中培养至对数中期。
- 采用醋酸锂(LiAc)法或制备电转化感受态细胞。LiAc/PEG法较为常用。
- 关键：保证细胞处于最佳生理状态（OD600 ≈ 0.5-0.8），严格控制无菌操作。
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酵母转化（文库构建核心步骤）：
- LiAc/PEG法（大批量）：
- 将酵母感受态细胞、文库质粒DNA（1-10 μg）、载体DNA（高效转化所需）、LiAc溶液、PEG溶液混合。
- 30°C热激一定时间。
- 离心去除转化混合液，重悬细胞于无菌水中。
- 电转化法（高效率）：
- 将提纯的文库质粒DNA与电转化感受态酵母细胞混合。
- 转移至预冷的电转杯中。
- 施加特定参数的脉冲（如1.5 kV, 25 μF, 200 Ω）。
- 立即加入复苏培养基。
- 关键： 使用足够量的DNA和高效率方法，以获得尽可能高的转化子数量（库容）。
- LiAc/PEG法（大批量）：
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文库扩增与库容测定：
- 将转化后的酵母细胞重悬于适量液体培养基。
- 取少量梯度稀释液涂布在选择性平板（如SD/-Leu for AD文库）上，用于计算库容。
- 剩余大部分细胞涂布在大型选择性琼脂平板上（如245 x 245 mm）或用液体培养基小规模扩增。
- 计算库容：统计平板上长出的菌落数，乘以稀释倍数和总悬液体积。理想库容至少是目标基因复杂度的5-10倍（通常要求 > 1x10⁶ CFU）。
- 重要： 严格控制扩增代数（通常只扩增一代），避免文库复杂度丢失和优势克隆过度生长。
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文库收集与保存：
- 平板法： 将大型平板上的菌落用含有甘油的液体培养基（含相应抗生素）洗脱下来。
- 液体法： 将小规模扩增的文库离心收集菌体。
- 与无菌甘油混合至终浓度15-25%。
- 分装成小份（避免反复冻融），在-80°C长期保存。
四、 文库质量评估关键指标
- 库容： 实际获得的独立转化子数量。必须满足筛选需求（远大于目标基因复杂度）。
- 滴度： 每毫升保存文库中可形成菌落的酵母细胞数（CFU/mL）。
- 插入片段大小分布：
- 随机挑取克隆（至少24个），提取质粒进行PCR或酶切。
- 琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小。计算平均插入片段长度。
- 理想文库应包含多种长度的片段，平均长度符合预期（常在0.5-2 kb）。
- 插入片段阳性率： 随机挑取的克隆中含有效插入片段的比例（应>80%）。
- 重组效率（空载体率）： 随机挑取的克隆中空载体或无插入克隆的比例（应尽可能低）。
- 文库代表性（复杂性）： 通过测序少量随机克隆或PCR分析特定基因是否存在，初步评估文库是否覆盖目标转录组或基因集。最可靠评估需大规模测序。
五、 特殊考量与优化
- 双杂诱饵蛋白自激活检测： 在文库筛选前，必须严格检测BD-Bait融合蛋白在报告株中的自激活能力。需在高选择性条件下（如增加3-AT浓度）确保无自激活。
- 毒性蛋白处理： 若预期文库包含可能对酵母有毒性的蛋白，需采用诱导型启动子表达文库。
- 构建方式选择： cDNA文库适合寻找新互作蛋白；ORF/结构域文库更适合研究已知蛋白间互作或特定区域。
- 均一化处理（可选）： 通过降低高丰度cDNA的比例，可提高发现低丰度转录本的几率，但操作复杂。
- Gateway克隆： 利用位点特异性重组构建文库，效率高、方向性好，是常用策略。
六、 成功关键与注意事项
- 起始材料质量： 高质量的RNA/DNA是构建高质量文库的基础。
- 载体与菌株匹配： 载体选择标记必须与酵母菌株的营养缺陷型精确匹配。
- 高效连接与转化： 优化连接反应和转化（酵母/细菌）效率是实现高库容的关键。
- 插入片段大小控制： 去除过小片段，富集中等长度片段，利于蛋白表达和相互作用。
- 降低空载背景： 载体去磷酸化、优化插入/载体比例至关重要。
- 严格控制扩增： 文库扩增代数过多会导致多样性丢失。尽量只扩增一代用于保存和筛选。
- 无菌操作： 全程严格无菌操作，防止污染。
- 充分质控： 在筛选前务必进行全面的库容、插入大小、阳性率等质控。
- 详细记录： 记录文库构建的每一步关键参数、试剂批次、结果（库容计算、质控结果）。
遵循上述详细步骤和关键注意事项，并投入足够的耐心和细致操作，即可构建出高质量、适用于酵母单/双杂交筛选的cDNA或基因文库，为后续发现重要的核酸-蛋白或蛋白-蛋白相互作用奠定坚实基础。