拉下实验（GST Pull-down) - 中析研究所生物检测中心

GST Pull-down 实验技术详解：捕获蛋白质相互作用的经典方法

GST Pull-down 实验（谷胱甘肽巯基转移酶下拉实验）是生物化学与分子生物学领域用于验证体外蛋白质间直接相互作用的核心技术。其核心在于利用 GST 标签蛋白与 谷胱甘肽包被的琼脂糖珠之间的高亲和力、特异性结合，从复杂混合物中“下拉”与诱饵蛋白结合的靶蛋白。

一、核心原理

构建融合蛋白： 将编码“诱饵”蛋白 (Bait) 的基因序列克隆至带有 GST 标签的载体中，表达产生 GST-Bait 融合蛋白。
捕获诱饵蛋白： 将 GST-Bait 融合蛋白与 富含谷胱甘肽的固相载体（通常为琼脂糖或磁珠）共同孵育。GST 标签与谷胱甘肽之间的高亲和力结合使 GST-Bait 牢固地固定在载体表面。
结合靶蛋白：
- 将固定有 GST-Bait 的载体与含有潜在“靶”蛋白 (Prey) 的溶液（如细胞裂解液、体外转录翻译产物、纯化蛋白）共同孵育。
- 若 Bait 与 Prey 存在直接相互作用，Prey 蛋白将被特异性捕获并结合到载体上。
洗涤与洗脱：
- 洗涤： 通过多次洗涤缓冲液去除未结合的、非特异性结合的蛋白质杂质。
- 洗脱：
  - 特异性洗脱： 加入高浓度（通常 10-20 mM）的还原型谷胱甘肽缓冲液。谷胱甘肽竞争性结合 GST 标签，将 GST-Bait 蛋白及其相互作用的 Prey 蛋白复合物洗脱下来。（最常用）
  - 非特异性洗脱： 使用含 SDS 的上样缓冲液沸水浴加热，释放所有结合在载体上的蛋白（包括 GST-Bait 和 Prey），用于后续检测（如 Western Blot）。
检测与分析：
- 洗脱产物通过 SDS-PAGE 电泳分离。
- 利用 Western Blotting 技术，使用针对靶蛋白 (Prey) 的特异性抗体进行检测。
- 阳性结果：在洗脱样品中检测到靶蛋白条带，表明 Bait 与 Prey 在体外存在直接相互作用。
- 关键对照：必须设置 GST 蛋白单独表达的 Pull-down 实验作为阴性对照，以排除靶蛋白非特异性结合 GST 或珠子的可能性。

二、所需核心试剂与材料

表达载体： 含 GST 标签序列的质粒载体（如 pGEX 系列）。
宿主细胞： 通常使用大肠杆菌（如 BL21(DE3)）诱导表达 GST 融合蛋白。
细菌培养基： LB 培养基。
诱导剂： 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
细胞裂解缓冲液： 含 Tris-HCl (pH 7.4-8.0)、氯化钠、去垢剂（如 Triton X-100 或 NP-40）、蛋白酶抑制剂混合物、苯甲基磺酰氟的磷酸盐缓冲液。
谷胱甘肽亲和介质： 谷胱甘肽固定化的琼脂糖珠或磁珠。
结合/洗涤缓冲液： 含 Tris-HCl (pH 7.4-8.0)、氯化钠、去垢剂（浓度通常低于裂解液）的磷酸盐缓冲液。
洗脱缓冲液： 含还原型谷胱甘肽（10-50 mM）的 Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0-8.5）。
蛋白电泳相关试剂： SDS-PAGE 凝胶制备试剂、电泳缓冲液、蛋白分子量标准。
蛋白转印相关试剂： 转印缓冲液、硝酸纤维素膜或 PVDF 膜。
抗体： 针对靶蛋白 (Prey) 的特异性一抗、相应的酶标二抗（如辣根过氧化物酶标记）。
显色/发光底物： 用于 Western Blot 检测（如 ECL 化学发光试剂）。

三、标准操作流程

表达 GST 融合蛋白：
- 将含 GST-Bait 的质粒转化入感受态大肠杆菌。
- 挑取单菌落接种培养至对数生长期。
- 加入诱导剂诱导表达（通常 37℃ 数小时或 16-18℃ 过夜）。
- 离心收集菌体。
制备 GST-Bait 融合蛋白溶液：
- 用预冷的裂解缓冲液重悬菌体沉淀。
- 超声破碎或酶解法裂解细胞。
- 高速离心去除细胞碎片，收集上清液（含可溶性 GST-Bait 蛋白）。可保留少量用于 SDS-PAGE 分析表达情况。
结合谷胱甘肽亲和介质：
- 取适量谷胱甘肽琼脂糖珠于离心管中。
- 用预冷的洗涤缓冲液洗涤珠子数次，去除储存液。
- 将含 GST-Bait 的上清液与处理好的珠子混合，在 4℃ 旋转孵育 1-2 小时。
洗涤 GST-Bait 融合蛋白：
- 离心沉淀珠子，小心吸弃上清。
- 用预冷的洗涤缓冲液充分洗涤珠子 4-5 次，每次需充分重悬珠子。去除未结合的杂蛋白。
与靶蛋白孵育：
- 将制备好的含靶蛋白 (Prey) 的溶液（细胞裂解液、体外翻译产物等）加入装有结合了 GST-Bait 珠子的离心管中。
- 在 4℃ 旋转孵育 1 至数小时（有时需要过夜），使相互作用充分发生。
洗涤去除未结合蛋白：
- 离心沉淀珠子，吸弃上清。
- 用预冷的洗涤缓冲液充分洗涤珠子 5-6 次以上，严格去除未结合和非特异性结合的蛋白。这是降低背景的关键步骤。最后一次洗涤后尽量吸干液体。
洗脱结合复合物：
- 方法一（还原型谷胱甘肽洗脱 - 用于后续分析）：
  - 加入适量新鲜配制的还原型谷胱甘肽洗脱缓冲液。
  - 在室温或 4℃ 温和旋转孵育 10-20 分钟。
  - 离心沉淀珠子，小心吸取上清（含洗脱下来的蛋白复合物）至新管。可重复洗脱一次合并洗脱液。
- 方法二（SDS 上样缓冲液洗脱 - 用于 WB）：
  - 直接向珠子中加入适量 2X SDS-PAGE 上样缓冲液。
  - 沸水浴加热 5-10 分钟。
  - 高速离心，吸取上清进行SDS-PAGE。
检测分析：
- 取适量洗脱液或裂解液输入样品进行 SDS-PAGE 电泳。
- 将蛋白转印至膜上。
- 利用针对靶蛋白 (Prey) 的特异性抗体进行 Western Blot 检测。
- 显色或化学发光成像。在 GST-Bait 实验组的洗脱样品中检测到靶蛋白条带，且在 GST 对照组的洗脱样品中没有该条带（或极弱），表明存在特异性相互作用。

四、关键优势

验证直接相互作用： 能在体外环境中验证两个蛋白是否直接结合。
相对简便： 操作流程相对标准化，所需设备常规。
功能域作图： 可用于确定蛋白质间相互作用所需的关键结构域（通过构建诱饵蛋白的不同缺失突变体）。
筛选互作蛋白： 可结合体外转录翻译系统或蛋白质组学方法（如质谱），用于初步筛选与诱饵蛋白相互作用的未知靶蛋白。
灵敏度与特异性： 经过优化（如严格洗涤）可获得较好的信噪比。

五、局限性及注意事项

体外非生理环境： 实验在裂解液环境中进行，可能丢失细胞内调控因子（如翻译后修饰伴侣、辅助因子等），不能完全模拟细胞内真实情况。阳性结果证明有直接结合能力，阴性结果不能完全排除体内存在相互作用（可能依赖桥梁蛋白或特定环境）。
非特异性结合： 高丰度、疏水性蛋白或带电荷蛋白容易非特异性结合到珠子或 GST 标签上。严格的阴性对照（GST alone）和充分的洗涤是关键！
融合标签影响： GST 标签较大（~26 kDa)，可能影响诱饵蛋白的空间构象、活性或相互作用位点，导致假阴性。需关注融合蛋白是否保持功能。
亲和力限制： 主要适用于中等及以上亲和力的相互作用。弱而短暂的相互作用可能难以检测。
洗涤强度： 洗涤不足导致高背景，洗涤过强可能导致真阳性结合被洗掉。需根据具体蛋白优化洗涤缓冲液成分（盐浓度、去垢剂种类和浓度）和洗涤次数。
蛋白状态： 蛋白的溶解性、折叠状态、降解情况都会影响结果。需确保诱饵蛋白和靶蛋白在实验条件下保持正确折叠和活性。使用蛋白酶抑制剂防止降解。

六、应用场景

验证酵母双杂交、Co-IP、蛋白质组学筛查等发现的潜在蛋白质相互作用对。
确定蛋白质相互作用的关键结构域或关键氨基酸残基。
研究相互作用复合物的组分（结合质谱分析）。
筛选小分子化合物对特定蛋白质相互作用的干扰或促进。

七、常见问题及优化策略

背景过高（假阳性）：
- 增加洗涤次数和/或强度（提高盐浓度、更换去垢剂、加入竞争剂）。
- 确保阴性对照（GST Alone）设置正确且结果干净。
- 优化裂解液和洗涤缓冲液配方。
- 使用预吸附过的裂解液（如先用空白珠子处理去除易结合珠子的蛋白）。
- 检查抗体特异性。
信号弱或无信号（假阴性）：
- 验证 GST-Bait 融合蛋白的表达水平和可溶性。
- 验证 GST-Bait 是否成功结合到珠子上（考马斯亮蓝染色或抗 GST WB）。
- 验证靶蛋白在输入样品中的量和状态。
- 增加诱饵蛋白与靶蛋白的孵育时间或浓度。
- 降低洗涤强度（如降低盐浓度、减少去垢剂、减少洗涤次数）。
- 优化孵育条件（如温度、pH、添加辅助因子）。
- 考虑标签位置（N端或C端）是否影响了相互作用位点。
- 检查蛋白稳定性（加入蛋白酶抑制剂）。

结论：

GST Pull-down 实验是研究蛋白质直接相互作用的强大工具，其原理清晰、操作相对便捷。清晰的结果依赖于严谨的实验设计（尤其阴性对照）、优化的实验条件（缓冲液、洗涤强度）以及对蛋白状态的把握。将其实验结果与体内相互作用验证方法（如荧光共振能量转移、邻近连接分析、免疫共沉淀结合质谱等）相结合，才能更全面地阐明蛋白质相互作用的生理功能和调控机制。该方法在信号通路解析、蛋白质复合物研究以及药物靶点发现等领域发挥着重要作用。

请注意： 本指南仅提供通用方法和原理。实际实验中，具体的缓冲液配方、孵育时间/温度、洗涤条件等都需要根据研究的特定蛋白质对进行优化。务必查阅相关文献并开展预实验进行条件摸索。