双分子荧光互补实验（BiFC）

发布时间：2025-06-14 16:38:40 阅读量：14 作者：生物检测中心
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双分子荧光互补技术 (BiFC)：照亮蛋白质相互作用的荧光探针

一、引言

在生命活动的复杂交响曲中，蛋白质扮演着核心角色，而它们之间的相互作用（Protein-Protein Interactions, PPIs）则是调控几乎一切生物学过程的关键音符。理解这些相互作用对于揭示疾病机制、开发新型药物至关重要。传统的PPI研究方法（如酵母双杂交、免疫共沉淀）虽然有效，但常常无法在活细胞、实时且直观地捕捉到互作发生的时空动态信息。双分子荧光互补技术（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）应运而生，它如同一把精密的“荧光锁”，在活细胞内将蛋白质的“相遇”转化为可见的荧光信号，为研究者打开了原位、实时观测PPIs的窗口。

二、技术原理：分割与重组的荧光魔法

BiFC技术的核心思想巧妙地利用了荧光蛋白（Fluorescent Protein, FP）的特性：将一个完整的荧光蛋白人为地分割成两个本身不具有荧光活性的片段（通常称为N端片段 FN 和C端片段 FC）。

  1. 片段设计与载体构建： 将目标蛋白A的基因与FN片段的基因融合（表达为 A-FN 融合蛋白），将目标蛋白B的基因与FC片段的基因融合（表达为 B-FC 融合蛋白）。
  2. 共表达与相互作用： 将编码这两种融合蛋白的载体共同导入活细胞（如哺乳动物细胞、植物细胞、酵母等）。当且仅当目标蛋白A和B发生特异性相互作用时，它们会相互靠近。
  3. 互补与发光： A-FN 和 B-FC 融合蛋白的靠近，使得原本分开的FN和FC片段在空间上紧密接近。这两个片段具有高度的亲和力，能够自发地重新组装（互补）形成一个类似完整结构的荧光蛋白复合物。
  4. 荧光信号产生： 互补形成的复合物恢复其荧光活性，在特定波长的激发光照射下发射出荧光。荧光的出现直接指示了蛋白质A和B在活细胞内的特定位置（如细胞核、细胞质、细胞膜、细胞器等）发生了相互作用。

三、实验流程概要

  1. 目标选择与片段设计： 选定待研究的蛋白质对（A和B）。根据实验需求和研究体系选择合适的荧光蛋白（如YFP及其变种Venus、Citrine，或CFP, GFP等）及其分割位点（常见的如YFP分割位点：YN(1-154/155), YC(155/156-238/239)）。
  2. 载体构建: 将目标蛋白A基因与FN片段基因克隆至一个表达载体，目标蛋白B基因与FC片段基因克隆至另一个表达载体。通常包含适当的启动子、筛选标记（如抗生素抗性基因）和融合连接肽（linker，保证融合蛋白柔韧性）。
  3. 细胞转染/转化： 将构建好的两种质粒（或病毒载体）共转染/转化到目标细胞系或模式生物（动物、植物、酵母等）中。需要优化转染效率和比例。
  4. 表达与孵育： 让细胞在适宜条件下（温度、湿度、CO2等）表达融合蛋白并发生潜在的相互作用和荧光互补。注意： BiFC互补一旦形成通常非常稳定，有时被称为“几乎不可逆”，这使得信号能积累并易于检测，但也可能捕获瞬时或非特异性的互作。
  5. 荧光检测与分析：
    • 显微镜成像： 最常用的是激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）或宽场荧光显微镜。在荧光蛋白对应的激发/发射波长下观察细胞。荧光的出现（而单独的A-FN或B-FC表达时无荧光）及其在细胞内的定位（共定位分析）直观地展示了蛋白质互作的发生位置。
    • 流式细胞术： 可用于定量分析群体细胞中发生互作（即发出荧光）的细胞比例和强度。
    • 荧光光谱测量： 可用于精确表征互补后荧光的发射光谱特性。
  6. 严格的对照实验： 这是BiFC实验成功和结果可靠的关键。
    • 阴性对照： A-FN + 空载体FC / B-FC + 空载体FN；已知不与A或B互作的蛋白X融合FN/FC与B-FC/A-FN共表达。这些组合理论上不应产生荧光信号。
    • 阳性对照： 使用已知发生强且特异互作的蛋白质对（如Fos-Jun, Leucine Zippers）分别融合FN和FC，作为实验体系有效性的验证。
    • 表达水平检测： 通过Western Blot或免疫荧光检测融合蛋白的表达情况，避免因表达失败或过低导致的假阴性。
    • 荧光蛋白完整性检测： 表达完整的荧光蛋白作为荧光参照。
    • 抗原性定位对照： 单独表达A-FN和B-FC（通常无荧光），用针对目标蛋白A或B的抗体进行免疫荧光染色，验证融合蛋白在细胞内的定位是否正常，排除因融合导致错误定位造成的假象。

四、BiFC技术的独特优势

  1. 活细胞实时成像： 最大优势在于能在活细胞、接近生理状态下直接观察蛋白质相互作用，提供动态和原位信息。
  2. 亚细胞定位精准： 可以直接可视化互作发生的精确亚细胞位置（如特定细胞器、膜结构域）。
  3. 直观可视： 荧光信号直接指示互作发生，无需复杂的生化处理或报告基因激活等间接手段，结果直观易懂。
  4. 适用性广： 已成功应用于多种模式生物（哺乳动物、植物、昆虫、酵母、细菌等）和各种细胞类型。
  5. 易于操作： 实验流程相对标准化，主要依赖于标准的分子克隆、细胞培养和荧光显微技术。
  6. 多色系统： 利用不同颜色荧光蛋白（如Venus-YFP, Cerulean-CFP, mCherry-RFP等）的分割片段，可同时研究多对蛋白质相互作用（多色BiFC），分析互作网络。

五、局限性及应对策略

  1. 假阳性风险：
    • 非特异性聚集： 过表达可能导致融合蛋白非特异性聚集，使FN/FC靠近而发光。
    • “几乎不可逆”性： 互补后复合物非常稳定，可能捕获瞬时、弱亲和力或非生理性的相互作用，并持续发光，导致信号不代表特定时间点的功能性互作。
    • 应对策略： 严格的阴性对照至关重要；优化表达水平（避免过高表达）；使用亲和力较低、互补效率较低的荧光蛋白变种；结合其他技术（如FRET、Co-IP）进行验证。
  2. 假阴性风险：
    • 空间位阻： 目标蛋白的互作界面或融合位点选择不当，可能阻碍FN/FC片段的接近和互补。
    • 折叠/定位异常： 融合可能干扰目标蛋白自身的正确折叠、修饰或定位，导致无法正常互作。
    • 互补效率不高： 某些分割位点或荧光蛋白变种的互补效率本身较低。
    • 应对策略： 尝试不同的融合位点（N端、C端或中间柔性连接区）；尝试不同的荧光蛋白或分割位点；使用更亮的荧光蛋白变种（如Venus）；确保融合蛋白表达和定位正确（对照实验）。
  3. 成熟速度慢： 互补形成后荧光蛋白恢复荧光需要时间（成熟），限制了测量快速动态变化的能力。使用成熟速度更快的荧光蛋白变种（如Venus比原始YFP快）可部分改善。
  4. 温度敏感性： 某些荧光蛋白（尤其是YFP及其变种）的互补效率或荧光强度可能受温度影响（如37℃下效率可能降低）。在允许条件下可尝试在较低温度（如30℃）下孵育以提高信号。
  5. 不能直接反映互作动力学： 由于互补的稳定性，BiFC主要反映互作是否发生及位置，难以精确量化互作的亲和力或动力学参数。常需结合其他技术（如FRAP, FLIM）研究动态。

六、应用领域

BiFC技术已成为解析蛋白质相互作用网络不可或缺的工具，广泛应用于：

  1. 信号转导通路研究： 可视化信号分子（激酶、磷酸酶、适配蛋白、转录因子等）之间在特定刺激下的互作激活、招募和解离。
  2. 膜蛋白互作研究： 研究受体、离子通道、转运蛋白等在细胞膜上的寡聚化状态及与其他蛋白的相互作用。
  3. 细胞器相互作用研究： 探索不同细胞器（如ER-线粒体接触点、自噬体形成等）膜蛋白间的互作桥梁。
  4. 转录调控研究： 观察转录因子、辅因子在细胞核内特定基因位点或亚核结构上的互作。
  5. 病毒学与宿主-病原体互作： 研究病毒蛋白之间的互作、病毒蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用机制。
  6. 药物筛选与作用机制研究： 利用BiFC作为报告系统，筛选能影响特定PPIs的小分子化合物，并观察药物对互作空间定位的影响。
  7. 植物生物学应用： 在植物中研究生长发育、胁迫响应、激素信号等过程中的关键蛋白互作。

七、技术发展与展望

BiFC技术本身也在不断改进和创新：

  1. 优化荧光蛋白： 开发更亮、成熟更快、光稳定性更好、互补效率更高、光谱特性更优化的单体荧光蛋白变种及其分割片段（如单体Venus, mCerulean3, mCherry的BiFC变种）。
  2. 多色系统拓展： 开发光谱分离更彻底的新荧光蛋白对，实现更多重（三重、四重）BiFC成像。
  3. 动态监测改进： 探索可逆互补系统（如利用光或化学诱导的二聚化原理构建可逆BiFC），或结合时间分辨成像技术（如FLIM-BiFC）来获取更多动态信息。
  4. 定量化： 结合先进成像分析和算法，尝试对BiFC信号进行更精确的定量，以比较互作强度。
  5. 与其他技术联用： BiFC常与FRET（分析互作构象变化）、BRET（更适合微量检测）、荧光相关光谱（FCS）等技术互补，提供更全面的PPI信息。BiFC-FRET联用可研究三元复合物形成。

八、结论

双分子荧光互补技术（BiFC）以其独特的能力——在活细胞内将蛋白质相互作用可视化——在分子和细胞生物学领域占据了重要地位。它利用荧光蛋白片段互补发光的原理，为研究者提供了原位、实时探测PPIs时空信息的强大窗口。尽管存在假阳性/假阴性等挑战，但通过严谨的实验设计、严格的对照以及持续的荧光蛋白工程优化，BiFC技术不断克服局限性，应用范围日益广泛。从基础信号通路研究到药物靶点发现，BiFC及其衍生技术将继续作为照亮蛋白质相互作用微观世界的“荧光探针”，深化我们对生命复杂运行机制的理解。

主要参考文献(示例格式)：

  • Hu, C. D., Chinenov, Y., & Kerppola, T. K. (2002). Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell, 9(4), 789–798. (开创性论文)
  • Kerppola, T. K. (2006). Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature Protocols, 1(3), 1278–1286. (经典方案)
  • Kerppola, T. K. (2008). Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annual Review of Biophysics, 37, 465–487. (权威综述)
  • Kodama, Y., & Hu, C. D. (2012). Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. BioTechniques, 53(5), 285–298. (进展综述)

(注意：本文仅提供概述，具体实验设计需根据研究目标和体系仔细优化。)