荧光素酶蛋白互作分析（Split-LUC）

发布时间：2025-06-14 16:36:25 阅读量：4 作者：生物检测中心
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荧光素酶蛋白互作分析（Split-Luciferase Complementation Assay, Split-LUC）

一、 技术原理

Split-LUC 技术是一种基于生物发光共振能量转移（BRET）原理，用于在活细胞或接近生理环境中实时、灵敏地检测蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）的强大工具。其核心策略是将一个完整的报告酶——荧光素酶（Luciferase） ——拆分成两个独立的、本身不具备催化活性或活性极低的功能片段（通常称为 N 端片段 NLuc 和 C 端片段 CLuc，或根据大小称为 LargeBiT 和 SmallBiT）。

  1. 片段化： 荧光素酶（常用的是 萤火虫荧光素酶 或更亮的 纳米荧光素酶）被基因工程改造，在特定位点被切割成两个片段。
  2. 融合表达： 这两个非功能片段（假设为 NLuc 和 CLuc）分别与待研究的两个潜在相互作用蛋白（Protein A 和 Protein B）进行融合表达，形成融合蛋白：Protein A-NLuc 和 Protein B-CLuc（或反过来）。
  3. 相互作用诱导互补： 当 Protein A 和 Protein B 在细胞内或体外环境中发生特异性相互作用时，会促使它们各自携带的 NLuc 和 CLuc 片段在空间上相互靠近。
  4. 活性恢复与发光检测： 空间上的接近使得 NLuc 和 CLuc 片段能够重新折叠，形成具有完整或接近完整酶活性的荧光素酶结构。此时，加入外源的底物（萤火虫荧光素或呋喃荧光素），恢复活性的荧光素酶即可催化底物发生氧化反应，产生生物发光信号（光子）。发光信号的强度与 Protein A 和 Protein B 相互作用的强度和发生相互作用的分子数量成正比。

二、 实验流程（典型活细胞检测）

  1. 载体构建：

    • 将目标蛋白 A 的基因克隆到含有一个荧光素酶片段（如 NLuc）的表达载体中。
    • 将目标蛋白 B 的基因克隆到含有互补荧光素酶片段（如 CLuc）的表达载体中。
    • 构建阴性对照：例如，将 NLuc 和 CLuc 片段分别与已知不相互作用的蛋白（或空标签）融合，或将其中一个目标蛋白替换为已知不相互作用的突变体/无关蛋白。
    • 构建阳性对照（可选但推荐）：使用已知强相互作用的蛋白对（如 Fos/Jun）连接到相同的 Split-LUC 系统中。

  2. 细胞转染/转导：

    • 将构建好的两组融合蛋白表达载体（Protein A-NLuc + Protein B-CLuc）共转染到合适的哺乳动物细胞、植物原生质体或其他细胞类型中。也可使用病毒载体进行稳定转导。
    • 同时转染阴性对照和阳性对照。

  3. 培养与处理：

    • 细胞在适宜条件下培养，使融合蛋白得以表达。
    • 若研究诱导型相互作用或药物处理效应，可在此时加入特定的刺激物、抑制剂或药物。

  4. 发光检测：

    • 底物添加： 向细胞培养体系中加入荧光素酶底物溶液（通常含有荧光素、ATP、Mg²⁺等必需成分）。对于纳米荧光素酶（NanoLuc），使用的是呋喃荧光素（Furimazine）或其优化衍生物（如 EnduRen™、Viviren™等），它们具有更好的细胞渗透性和稳定性，尤其适合长时间动力学监测。
    • 信号读取： 使用化学发光检测仪（如酶标仪配备化学发光模块、活体成像系统或发光计）实时或终点法测量产生的生物发光信号（通常以相对发光单位 RLU 表示）。
    • 检测模式：
      • 终点法： 在特定时间点（如转染后 24-48 小时）加底物并立即读数。
      • 动力学监测： 连续或间隔读取发光信号，观察相互作用随时间或处理条件的变化。

  5. 数据分析：

    • 比较实验组（Protein A-NLuc + Protein B-CLuc）与阴性对照组的发光信号。显著高于阴性对照的信号表明 Protein A 和 Protein B 存在相互作用。
    • 通常会将发光信号归一化（如除以共转染的荧光蛋白表达量来校正转染效率差异）。
    • 计算信噪比（实验组 RLU / 阴性对照 RLU）或进行统计学分析（如 t 检验、ANOVA）。

三、 技术优势

  1. 高灵敏度： 荧光素酶催化反应产生的光信号背景极低，使其具有极高的检测灵敏度，能检测到微弱或瞬时的相互作用。
  2. 实时动态监测： 尤其在使用稳定性好的底物（如 EnduRen™）时，可在活细胞内对 PPIs 进行长时间、非侵入性的实时监测，研究相互作用的动力学过程（如信号传导、药物作用）。
  3. 生理相关性： 主要在活细胞内进行，蛋白质在接近其天然环境（包括正确的亚细胞定位、翻译后修饰、辅助因子）下表达和相互作用，结果更具生理意义。
  4. 低背景/高信噪比： 非相互作用的片段通常无法互补产生有效发光，背景信号低。
  5. 适用于多种样本： 不仅可用于培养细胞，还可扩展到植物组织、模式生物（如线虫、斑马鱼、小鼠活体成像）以及体外纯化的蛋白样品。
  6. 信号放大效应： 一个酶分子可催化多个底物分子反应产生大量光子，具有信号放大作用。
  7. 定量化： 发光强度通常与相互作用的蛋白复合物量成正比，可进行半定量或定量分析。
  8. 通量潜力： 适用于 96 孔板或 384 孔板形式，可用于中等通量的药物筛选（寻找 PPI 抑制剂/激动剂）。

四、 技术局限性与注意事项

  1. 间接检测： 检测的是荧光素酶片段互补后产生的发光信号，而非相互作用本身。需要谨慎排除假阳性和假阴性。
  2. 片段大小与融合位置： 荧光素酶片段的大小及其与目标蛋白融合的位置（N端或C端）可能影响目标蛋白的结构、功能、定位以及相互作用能力。通常需要优化融合策略（不同末端、添加柔性连接肽）。
  3. 空间位阻： 如果相互作用界面靠近融合位点，荧光素酶片段的空间位阻可能阻碍互补或影响目标蛋白的相互作用。
  4. 表达水平与平衡： 两个融合蛋白的表达水平不平衡可能影响互补效率和信号强度。需优化转染比例或使用双顺反子载体。
  5. 假阳性：
    • 非特异性聚集： 片段过表达可能导致非特异性的聚集和互补。
    • 随机碰撞： 在高浓度下，即使没有特异相互作用，片段也可能因随机碰撞发生瞬时互补产生背景信号。良好的阴性对照至关重要。
  6. 假阴性：
    • 融合破坏了目标蛋白的结构、定位或相互作用界面。
    • 相互作用较弱或瞬时。
    • 片段互补效率低（互补位点设计不佳）。
  7. 底物成本： 优质的商业化底物（尤其适用于活细胞长时间成像的）成本可能较高。
  8. 仪器依赖： 需要化学发光检测设备。

五、 应用领域

Split-LUC 技术因其独特的优势，在生命科学研究中广泛应用：

  1. 验证已知或候选 PPIs： 在活细胞环境中验证通过酵母双杂交、生物信息学预测等方法发现的相互作用。
  2. 绘制相互作用结构域/关键残基： 通过构建目标蛋白的截短体或点突变体融合片段，研究相互作用所需的结构域或关键氨基酸残基。
  3. 研究信号通路： 实时监测信号传导过程中关键蛋白（如受体-配体、激酶-底物、适配体蛋白之间）相互作用的动力学变化。
  4. 药物筛选与发现：
    • 筛选靶向特定 PPI 的小分子抑制剂（降低发光信号）。
    • 筛选 PPI 稳定剂或激动剂（增强发光信号）。
    • 评估药物对通路中关键节点相互作用的调控作用。
  5. 蛋白折叠与功能研究： 利用片段互补研究蛋白折叠、构象变化或分子伴侣功能。
  6. 膜蛋白相互作用研究： 相比于酵母双杂交，Split-LUC 更适用于研究位于膜上（如 GPCRs）的蛋白相互作用。
  7. 活体成像： 利用报告基因特性，在模式生物体内可视化特定细胞类型或组织中发生的 PPIs。

六、 发展

Split-LUC 技术仍在不断发展中：

  • 优化片段： 开发更小、互补效率更高、背景更低的新型荧光素酶片段（如 NanoBiT™ 系统基于 NanoLuc 的 LargeBiT 和 SmallBiT）。
  • 多功能报告系统： 与其他技术（如荧光蛋白 FRET、Split-TEV）结合，实现多重检测或级联反应。
  • 临近诱导（Induced Proximity）应用： 基于 Split-LUC 原理发展新型生物传感器，如检测第二信使（cAMP, Ca²⁺）、蛋白酶活性等。
  • 三重片段互补系统： 用于研究三元复合物的形成。

总结：

Split-LUC 是一种强大且灵敏的工具，为在活细胞及生理相关环境中研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了实时、定量的解决方案。尽管存在一些局限性，但其高灵敏度、低背景、实时动态监测能力以及对生理环境的适应性，使其在基础研究（如信号通路解析、蛋白功能研究）和应用研究（如药物靶点验证和高通量药物筛选）中都具有不可替代的价值。精心设计的实验方案、严格的对照设置以及对结果谨慎的解释是成功应用该技术的关键。