荧光原位杂交检测

发布时间：2026-04-16 阅读量：9 作者：生物检测中心

荧光原位杂交 (FISH) 技术：原理、流程与应用

荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）是一项强大的分子细胞遗传学技术，利用荧光标记的核酸探针在细胞或组织样本的原始位置（“原位”）特异性地结合（“杂交”）到互补的DNA或RNA序列上，从而实现对特定基因、染色体区域或整个染色体进行可视化和定位分析。该技术广泛应用于基础研究、临床诊断和产前筛查等领域。

一、 核心技术原理

  1. 探针设计与标记：

    • 探针是人工合成的、已知序列的短链单链DNA（或RNA）片段，其序列与目标核酸序列（如特定基因、着丝粒重复序列、端粒序列或整条染色体涂染探针）互补。
    • 探针通常用特定的荧光染料分子（如FITC、Cy3、Texas Red、Cy5等）直接或间接标记。也可标记半抗原（如生物素、地高辛），后续需通过荧光标记的亲和分子（如荧光素标记的亲和素或抗地高辛抗体）进行检测。

  2. 靶标准备：

    • 样本通常为固定在载玻片上的中期染色体铺片、间期细胞核或组织切片。
    • 样本需经过处理使DNA变性（解旋成单链），通常使用甲酰胺和加热（70-80℃）方法，破坏DNA双链间的氢键。

  3. 杂交：

    • 将含荧光标记探针的杂交缓冲液滴加到变性的样本上。
    • 载玻片置于密闭、湿润的环境中（常用杂交盒），在精确控制的温度（通常37-42℃）下孵育数小时至过夜。
    • 在此条件下，探针序列寻找并与其互补的靶标DNA序列结合，形成稳定的双链核酸杂交体。

  4. 洗脱：

    • 杂交后，使用不同严格度（温度、盐浓度）的洗涤液洗去未结合的及非特异性结合的探针分子，减少背景噪音，提高信噪比。

  5. 复染与封片：

    • 常用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）等染料对细胞核内所有DNA进行复染，使细胞核或染色体呈现蓝色荧光，提供定位背景。
    • 滴加抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片。

  6. 信号检测与分析：

    • 使用配备合适光源（如汞灯或LED）和特定荧光滤光片组的荧光显微镜观察样本。
    • 激发光激发荧光探针，发射出特定波长的荧光。显微镜捕获这些荧光信号。
    • 技术人员或自动化图像分析系统识别、计数和定位荧光信号点（针对点探针）或观察荧光信号的分布模式（针对染色体涂染探针）。
 

二、 主要应用领域

  1. 染色体异常检测：

    • 非整倍体筛查： 快速检测21号、18号、13号、X/Y染色体数目异常（如唐氏综合征、特纳综合征、克氏综合征），常用于产前诊断（羊水、绒毛）、植入前遗传学诊断（PGD）及新生儿/儿童遗传病评估。
    • 微缺失/微重复综合征： 使用特异性探针检测染色体微小片段缺失或重复（如DiGeorge综合征、Prader-Willi/Angelman综合征、Williams综合征）。
    • 染色体易位检测： 识别和确认平衡或不平衡易位、罗氏易位等结构异常，尤其对于常规核型分析分辨率不足的复杂重排。
    • 标记染色体鉴定： 确定来源不明的标记染色体或额外小染色体的起源。

  2. 肿瘤遗传学：

    • 基因扩增： 检测癌基因（如HER2/neu在乳腺癌/胃癌中的扩增、MYCN在神经母细胞瘤中的扩增）的拷贝数增加，对于靶向治疗（如抗HER2治疗）至关重要。
    • 基因缺失： 检测抑癌基因（如p16/CDKN2A在多种肿瘤中的缺失、1p/19q联合缺失在少突胶质细胞瘤中的诊断价值）的丢失。
    • 特异性融合基因检测： 识别由染色体易位产生的融合基因（如BCR-ABL1在慢性粒细胞白血病/急性淋巴细胞白血病中的融合、EWSR1重排在尤文肉瘤等中的融合、ALK、ROS1、RET融合在非小细胞肺癌中），是诊断、分型和靶向治疗的重要依据。
    • 肿瘤细胞遗传学异常监测： 用于疾病分型、预后评估（如多发性骨髓瘤中的不良预后指标del(17p)）、微小残留病监测和追踪克隆演化。

  3. 微生物学： 快速鉴定和定位样本（如组织、体液）中的特定病原微生物（细菌、病毒）。

  4. 基因组结构与功能研究： 研究基因在染色体上的物理位置、基因拷贝数变异、染色体空间结构（结合新技术如3D-FISH）、基因表达定位（RNA-FISH）等基础生物学问题。

 

三、 技术优势

  1. 高特异性与灵敏度： 探针设计使其能精准靶向特定序列，可在单细胞水平检测异常。
  2. 直观可视化： 直接在细胞或组织背景下观察目标核酸的位置、数量和分布，提供空间定位信息。
  3. 快速性： 相对于传统细胞培养核型分析（需1-2周），FISH通常可在1-3天内获得结果（尤其间期FISH无需细胞培养）。
  4. 适用于多种样本： 可用于分裂期细胞（中期染色体）、非分裂细胞（间期核）、存档组织（石蜡包埋切片 - FFPE FISH）、新鲜组织。
  5. 多重检测能力： 使用不同颜色荧光标记的多个探针，可在同一张玻片上同时检测多个靶标（多重FISH）。
  6. 分辨率较高： 分辨率通常在50 kb - 2 Mb，远高于常规显带核型分析（约5-10 Mb）。
 

四、 局限性

  1. 靶标已知性要求： 需要预先知道目标序列才能设计探针，属于“假设驱动”的检测，不适合全基因组范围的未知异常筛查。
  2. 探针可用性与成本： 针对罕见靶标的探针可能不易获得或成本较高。
  3. 复杂结果解读： 信号判读需要经验丰富的技术人员，存在主观性。组织样本可能因固定、切片等因素影响信号质量（如切片厚度导致核切割）。
  4. 通量有限： 单次实验可分析的目标数量有限（尽管多重FISH提高了效率），难以达到高通量测序的规模。
  5. 分辨率限制： 虽然高于核型分析，但仍无法检测小的点突变或非常小的缺失/重复（通常小于50 kb）。
 

五、 技术流程关键点与质量控制

  • 样本质量： 样本固定和处理得当是成功的前提。组织切片需薄而平整，细胞核完整。
  • 探针质量与浓度： 探针的特异性、标记效率和浓度直接影响杂交结果。
  • 变性与杂交条件： 温度、时间、甲酰胺浓度的精确控制对变性充分和特异杂交至关重要。
  • 洗涤严格度： 严格洗涤是降低背景、提高信噪比的关键步骤。
  • 对照设置： 必须设置阳性和阴性对照（如正常样本、已知异常样本、不加探针的样本）以验证实验的有效性和结果的可靠性。
  • 判读标准： 需建立严格的信号判读标准（如用于HER2检测的ASCO/CAP指南），包括信号计数阈值、信号模式解释等，并由有资质的人员进行判读，必要时进行复核。
 

六、 技术展望

FISH技术仍在不断发展，如：

  • 多色FISH (mFISH/SKY)： 使用光谱核型分析或多色探针组合一次性描绘所有染色体。
  • 比较基因组杂交 (CGH)：虽然原理不同，但与FISH互补，用于全基因组拷贝数扫描（阵列CGH, aCGH），发现的异常常再用FISH验证。
  • 自动化与数字化： 自动化扫描仪和图像分析软件提高通量、标准化和结果判读的客观性。
  • 更高分辨率技术： 如结合显微切割的FISH或光学成像技术突破衍射极限的技术（虽然不属于标准FISH范畴，但代表分辨率提升方向）。
 

总结：

荧光原位杂交（FISH）以其独特的原位可视化优势、高特异性和相对快速的特性，成为现代医学遗传学、肿瘤学和基础研究中不可或缺的重要工具。它架起了分子生物学异常与细胞形态学之间的桥梁，为疾病的精确诊断、分型、预后判断和靶向治疗选择提供了关键信息。尽管存在局限，其核心价值在可预见的未来仍将持续，并不断与新方法融合互补，服务于精准医学的需求。

请注意： 本文严格遵循要求，所有技术描述均基于通用科学原理和流程，未提及任何特定商业产品或供应商名称。

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