原核系统蛋白表达

原核系统蛋白表达技术指南

引言 原核表达系统（主要指大肠杆菌）因其遗传背景清晰、培养简便、成本低廉、表达效率高等显著优势，成为重组蛋白制备和研究的最常用平台。它特别适用于快速获取毫克至克级目标蛋白，广泛应用于科学研究、结构解析及部分工业酶制剂生产。

核心原理 通过基因工程手段，将外源基因克隆至特定的原核表达载体中，转化进入宿主菌（常用大肠杆菌菌株）。在特定诱导条件下（通常是添加化学诱导剂），宿主菌强大的转录翻译机制被激活，大量合成目标蛋白。

核心流程

1. 载体构建：

   • 选择合适的表达载体： 载体需包含以下关键元件：
     • 强启动子： 如T7、lac、trp、tac等，精确调控基因转录起始。
     • 多克隆位点： 方便外源基因插入。
     • 筛选标记： 抗生素抗性基因（如氨苄青霉素、卡那霉素抗性基因等），用于筛选阳性转化子。
     • 融合标签： 常携带组氨酸标签、GST标签、MBP标签等，极大简化后续纯化和检测。
     • 核糖体结合位点： 保证mRNA有效翻译起始。
   • 目的基因克隆： 通过限制性酶切连接或同源重组等方法，将目标基因片段精准插入表达载体。

2. 宿主菌转化：

   • 将重组载体导入经特殊处理（如氯化钙法或电穿孔法）处于感受态的大肠杆菌细胞中。

3. 小规模表达测试与优化：

   • 初筛： 挑选转化子，小规模（如5-10mL）培养。
   • 诱导条件优化： 是关键步骤。需系统测试：
     • 诱导时机： 通常在菌液达到特定密度时添加诱导剂（如IPTG）。
     • 诱导剂浓度： IPTG浓度梯度测试（如0.1-1mM）。
     • 诱导时间： 不同时长（如2-6小时或过夜）。
     • 培养温度： 常测试37℃、30℃、25℃、甚至更低（如16℃），低温常有助于提高可溶性蛋白比例。
   • 表达分析： 收集诱导前后菌体，裂解后通过SDS-PAGE电泳分析表达情况（目标条带大小、表达量、可溶性）。

4. 大规模表达：

   • 根据优化条件，进行升规模培养（如1L或更大体积）。
   • 在最佳生长密度时加入精确计量的诱导剂，并在优化温度下诱导预定时间。

5. 菌体收获与裂解：

   • 离心收集菌体沉淀。
   • 使用物理方法（超声破碎、高压均质）或化学/酶学方法裂解细胞，释放胞内蛋白。

6. 蛋白纯化：

   • 离心/过滤： 去除细胞碎片和不溶物。
   • 亲和层析： 最常用第一步纯化（针对His标签、GST标签等），特异性高，步骤简单。
   • 离子交换层析、疏水层析、分子筛层析： 用于进一步精细纯化，提高纯度，去除杂质、内毒素、核酸等。
   • 包涵体处理（若为不溶）： 需洗涤、变性溶解（如使用高浓度尿素或盐酸胍），再通过稀释或透析缓慢复性。

7. 蛋白分析与保存：

   • 鉴定： SDS-PAGE、Western Blot确认目标蛋白大小和特异性。
   • 纯度分析： SDS-PAGE、HPLC等。
   • 浓度测定： Bradford法、BCA法、紫外分光光度法等。
   • 活性检测（如适用）： 针对目标蛋白功能进行相应活性测定。
   • 保存： 纯化蛋白通常在缓冲液中于-80℃分装冻存，或添加稳定剂（如甘油）于-20℃保存。长期贮存需严格避免反复冻融。

主要优势

• 操作快速简便： 遗传操作成熟，周期短（通常数天至一周）。
• 成本低廉： 培养基成分简单，发酵设备要求相对较低。
• 表达产量高： 可实现目标蛋白占菌体总蛋白10-30%甚至更高。
• 技术成熟： 拥有大量优化的载体、菌株和方法学支持。
• 易于放大： 从摇瓶到大型发酵罐的工艺放大相对成熟。

挑战与局限性

• 缺乏复杂翻译后修饰： 大肠杆菌无法进行真核细胞特有的糖基化、磷酸化（特定位点除外）、复杂二硫键形成等修饰，限制了表达具有此类修饰功能的真核蛋白。
• 蛋白折叠问题（包涵体）：
  • 高表达率常导致蛋白错误折叠、聚集形成不溶性包涵体。
  • 包涵体蛋白需经变性、复性才能恢复活性，过程复杂且得率常较低。
  • 对策：使用分子伴侣共表达菌株、降低诱导温度/时长、尝试分泌表达或不同融合标签。
• 内毒素污染： 大肠杆菌细胞壁含内毒素（LPS），纯化难度高，对细胞实验或体内应用有严格限制。
• 蛋白酶降解： 宿主菌内源性蛋白酶可能降解目标蛋白。
  • 对策：选用蛋白酶缺陷型菌株（如BL21(DE3)的衍生株）；降低培养温度；添加蛋白酶抑制剂；缩短诱导时间；尝试分泌表达。
• 起始密码子偏好性： 大肠杆菌对ATG（甲硫氨酸）起始效率最高，其他起始密码子（如GTG）效率较低。
• 稀有密码子问题： 外源基因中的稀有密码子可能导致翻译提前终止或错误。
  • 对策：使用补充稀有tRNA的专用菌株；对基因序列进行密码子优化。

常用宿主菌株

• 基础表达菌株： 如BL21(DE3)及其衍生株。DE3表示基因组上整合了T7 RNA聚合酶基因，受lacUV5启动子调控（可被IPTG诱导）。
• 解决特定问题的菌株：
  • 增强二硫键形成： Origami系列（谷胱甘肽还原酶/硫氧还蛋白还原酶双突变）。
  • 促进可溶性表达： Rosetta系列（补充稀有tRNA）、BL21(DE3)pLysS（低水平表达T7溶菌酶，降低基础表达）、C43/C44衍生株（适合表达膜蛋白或毒性蛋白）。
  • 降低蛋白酶活性： BL21(DE3) Star等（蛋白酶活性降低）。
  • 增强分泌能力： 部分改造菌株可用于周质表达。

表达策略优化关键点

• 融合标签选择： His标签最常用，纯化便利但对某些蛋白功能可能有影响；MBP、GST、Trx等标签本身较大，常能显著提高目标蛋白可溶性。
• 诱导条件精确控制： 温度、诱导剂浓度和诱导时间是影响可溶性与包涵体比例的核心变量。强烈建议进行梯度优化。
• 周质空间分泌： 通过添加特异性信号肽序列（如pelB, ompA），可将表达蛋白转运至细胞周质，提高正确折叠概率（利于含二硫键蛋白），并简化纯化（周质组分相对简单）。
• 分子伴侣/折叠酶共表达： 在表达载体或宿主菌中引入分子伴侣（如GroEL/ES, DnaK/DnaJ/GrpE）或二硫键异构酶基因（如DsbC），有助于目标蛋白正确折叠。

主要应用领域

• 科学研究：基础生物化学、结构生物学（X射线晶体学、冷冻电镜、NMR）、酶学与功能研究。
• 抗体片段（如scFv, Fab片段）生产。
• 诊断试剂开发：抗原制备、酶标记物生产。
• 工业酶制剂生产（如洗涤剂酶、淀粉酶等）。
• 生物技术工具酶生产（如限制性内切酶、聚合酶）。

结语 原核蛋白表达系统是重组蛋白制备的强大工具。其成功运用高度依赖于对基本原理的掌握、系统的优化流程（特别是载体构建、菌株选择和诱导条件）以及对固有局限性（如修饰缺失、包涵体形成）的针对性解决策略。尽管在表达复杂真核蛋白时面临挑战，其在快速、经济、高效获取大量蛋白方面的重要地位不可替代。