体外皮肤致敏替代试验

发布时间：2026-04-16 阅读量：21 作者：生物检测中心

体外皮肤致敏替代试验：迈向无动物安全评估的未来

皮肤致敏，即过敏性接触性皮炎，是化学品、化妆品、药品乃至医疗器械引发的重要不良健康效应。传统上，该风险依赖于动物试验（如豚鼠最大化试验、小鼠局部淋巴结试验）进行评估。然而，在科学伦理（3R原则：减少、优化、替代动物使用）和法规（如欧盟化妆品法规全面禁售动物测试化妆品）的双重推动下，体外皮肤致敏替代试验已成为至关重要的研究领域与合规工具。这些方法旨在通过模拟人体皮肤致敏关键生物学事件（Key Events, KEs），在实验室环境中预测物质的致敏潜力。

一、 理解皮肤致敏的生物学机制：AOP框架

体外替代试验的基石是皮肤致敏的“不良结局路径”（Adverse Outcome Pathway, AOP）。该框架将复杂的生物学过程分解为一系列可测量的关键事件：

  1. 起始事件 - 分子起始事件（Molecular Initiating Event, MIE）： 致敏原（通常是亲电性小分子或能转化为亲电分子的前致敏原）与皮肤蛋白质形成共价键，导致蛋白质修饰（亲电作用或氧化还原作用）。
  2. 关键事件 1（KE1） - 角质形成细胞活化： 被修饰的蛋白质或反应过程中产生的危险信号激活皮肤角质形成细胞。表现为：
    • 炎症因子（如IL-18, IL-1α, TNF-α）释放。
    • 抗氧化反应元件（ARE）依赖的细胞防御通路激活。
    • 特定基因（如与氧化应激、炎症相关基因）表达上调。
  3. 关键事件 2（KE2） - 树突状细胞活化： 活化的角质形成细胞释放的信号募集并激活表皮朗格汉斯细胞（LCs，皮肤主要的抗原提呈细胞）。活化的LCs：
    • 上调共刺激分子（如CD86, CD54）表达。
    • 摄取并处理修饰过的蛋白质（抗原）。
    • 迁移至引流淋巴结。
  4. 关键事件 3（KE3） - T细胞活化与增殖： 迁移至淋巴结的LCs将加工后的抗原提呈给初始T细胞，导致致敏原特异性效应T细胞（主要是CD8+ T细胞）的活化、克隆增殖和分化。
  5. 不良结局（AO）： 致敏个体再次接触相同致敏原时，活化的效应T细胞识别抗原并引发皮肤炎症反应（湿疹），即过敏性接触性皮炎。
 

体外替代试验的设计正是聚焦于模拟和测量AOP中特定的一个或几个关键事件（主要是MIE, KE1, KE2）。

二、 主流的体外皮肤致敏替代试验方法

基于其靶向的关键事件，现有成熟并被监管机构采纳或处于验证阶段的体外方法主要包括以下几种类型：

  1. 靶向分子起始事件的试验（化学反应性评估）：

    • 直接肽反应试验（DPRA - OECD TG 442C）：
      • 原理： 模拟MIE。测试物质与含有亲核氨基酸赖氨酸（含游离ε-氨基）和半胱氨酸（含游离巯基）的合成肽（半胱氨酸肽和赖氨酸肽）在体外共孵育。
      • 测量终点： 使用高效液相色谱（HPLC）分析测试物质与肽共孵育后肽的消耗（减少）百分比。消耗越高，表明物质与肽（模拟皮肤蛋白）发生共价结合的能力越强。
      • 预测能力： 主要识别物质作为半抗原与蛋白质发生共价结合的能力（致敏的必要前提）。区分强致敏原、弱致敏原和非致敏原（特别是对蛋白质的结合能力）。

  2. 靶向角质形成细胞活化（KE1）的试验：

    • ARE-Nrf2荧光素酶试验（KeratinoSens™ - OECD TG 442D & LuSens）：

      • 原理： 模拟KE1中ARE通路激活。使用基因工程改造的人永生化角质形成细胞系（如用于KeratinoSens™的HaCaT细胞或用于LuSens的NHEK细胞），其中ARE通路控制荧光素酶报告基因的表达。
      • 测量终点： 测试物质处理后，若激活ARE-Nrf2通路，荧光素酶表达增加，产生的发光信号增强（通过化学发光法检测）。通常设定荧光素酶活性诱导超过基线一定倍数（如1.5倍）且无细胞毒性的浓度作为阳性判断标准。
      • 预测能力： 识别能诱导皮肤细胞氧化应激反应（KE1的一部分）的物质。KeratinoSens™和LuSens原理相似，使用不同细胞系，可相互补充验证。

    • 人细胞系活化试验（h-CLAT - OECD TG 442E）与U-SENS™/U937细胞系活化试验（OECD TG 442E）：

      • 原理： 模拟树突状细胞活化（KE2）。h-CLAT使用人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1），U-SENS™使用人组织细胞淋巴瘤细胞系（U937）。这些细胞具有类似树突状细胞的特性。
      • 测量终点： 暴露于测试物质后，检测细胞表面共刺激分子CD86和/或CD54的表达水平（通常通过流式细胞术）。显著上调这些标记物（基于Fold Change和相对细胞活力）表明细胞被活化。
      • 预测能力： 识别能激活树突状细胞（KE2）的物质。这两种方法都包含在OECD TG 442E中，可作为等效方法使用。

    • IL-8 Reporter Luc Assay (IL-8 Luc) - OECD TG 草案（2023年）：

      • 原理： 模拟KE1角质形成细胞活化中的炎症反应。使用工程化的HaCaT细胞，其中IL-8启动子控制荧光素酶报告基因表达。
      • 测量终点： 测试物质处理后，若诱导IL-8表达，荧光素酶活性增加（通过化学发光法检测）。
      • 预测能力： 识别能诱导角质形成细胞炎症反应（KE1的另一重要方面）的物质。是对ARE通路试验的重要补充。
 

三、 验证、接受与法规应用

这些体外方法经历了严格的国际验证程序（如ECVAM协调），以评估其可靠性（实验室内和实验室间重现性）和相关性（预测能力）。其科学价值和应用潜力已获得广泛认可：

  • OECD测试指南（TG）: DPRA (442C), KeratinoSens™ (442D), h-CLAT/U-SENS™ (442E) 已成为正式的OECD测试指南，为全球化学品安全管理提供标准方法。IL-8 Luc正在草案阶段，接近正式采纳。
  • 监管应用：
    • 化妆品（欧盟及其他地区）： 体外方法是满足欧盟化妆品法规（EC No 1223/2009）完全禁止动物测试要求的核心工具，用于新原料和新配方的致敏性安全评估。
    • 化学品（REACH, GHS）： 在欧洲化学品管理局（ECHA）管理的REACH法规下，体外方法被接受用于满足皮肤致敏终点信息要求，特别是在动物测试被限制或需要优先排序的情况下。它们也支持全球化学品统一分类和标签制度（GHS）下的危害分类。
    • 药物与医疗器械： 日益被用于原料药、辅料、成品制剂及医疗器械材料的致敏性风险评估，作为非临床安全性评价的一部分。
  • 整合评估策略（IATA）： 单一体外方法通常难以覆盖AOP所有复杂步骤。因此，整合策略成为主流：
    • 基于定义的AOP框架： 明确选择不同KE的试验进行组合。
    • 数据驱动整合： 根据已有的数据库和预测模型（如QSAR），指导试验选择和结果解读。
    • 权重证据法（WoE）： 综合所有可用的信息（体外试验结果、化学结构特征、物理化学性质、有限量的体内数据、交叉致敏信息、人类数据如斑贴试验等）进行全面评估，得出结论（如区分致敏原/非致敏原，或评估致敏强度等级）。OECD也发布了相关指导（GD 256，GD 497）。
 

四、 优势、局限与未来方向

  • 优势：
    • 符合3R原则： 显著减少或避免动物使用。
    • 提高通量与降低成本： 相比动物试验，通常更快、更经济。
    • 人源相关性： 基于人源细胞/机制，减少物种差异担忧（特别是针对KE1/KE2的试验）。
    • 机理洞察： 提供物质作用机制的深入理解。
    • 适用于高通量筛选： 尤其适用于早期研发中对大量化合物进行快速筛选。
  • 局限与挑战：
    • 复杂性模拟不足： 目前方法主要模拟单个或少数KE，无法完全完整生物体内极其复杂的免疫应答（如T细胞活化KE3）和个体间差异（如遗传多态性）。
    • 代谢活化与屏障穿透： 许多方法缺乏皮肤完整的代谢能力和物理屏障（角质层），对需要代谢激活的前致敏原或穿透能力受限物质的评估存在挑战（尽管DPRA等化学方法不受代谢限制）。
    • 弱致敏原和混合物： 准确区分弱致敏原与非致敏原，以及评估复杂混合物（如成品化妆品）的致敏性仍是难点。
    • 定量预测强度： 尽管能区分致敏潜力，但目前方法在精确预测致敏强度（如EC3值）方面能力有限。
    • 标准化与实施： 持续需要优化协议、加强实验室间标准化、培训操作人员并建立广泛认可的数据解读框架（IATA）。
  • 未来方向：
    • 新模型开发： 开发更复杂的体外模型，如3D皮肤表皮模型（含功能化角质层）、包含多种细胞类型（角质形成细胞、树突状细胞、T细胞）的共培养模型、以及使用原代细胞或诱导多能干细胞（iPSC）来源细胞的模型，以期更贴近真实皮肤微环境和免疫过程。
    • 靶向新关键事件： 开发模拟KE3（T细胞活化）的体外方法（如T细胞启动测定）。
    • 高通量组学技术整合： 结合转录组学、蛋白组学等方法，获取更全面的生物反应谱图。
    • 人工智能与数据分析： 利用AI/ML分析复杂数据集，改进预测模型和IATA决策框架。
    • 监管协调与合作： 加强全球监管机构间的合作，促进体外方法在更多地区和法规领域的接受和实施指南的统一。
 

结论

体外皮肤致敏替代试验已经从概念发展成为化学品、化妆品等产品安全评估中不可或缺的支柱工具。基于对皮肤致敏AOP的深入理解，一系列靶向不同关键事件的标准化方法（如DPRA, KeratinoSens™/LuSens, h-CLAT/U-SENS™, IL-8 Luc）已被广泛验证并纳入国际测试指南。通过整合测试策略（IATA）和权重证据法，这些体外方法能够有效地预测物质的致敏潜力，显著减少乃至取代传统的动物试验，特别是在化妆品领域。尽管在模拟复杂生理环境、评估弱致敏原和精确量化强度方面仍存在挑战，持续的研究和技术革新（如复杂体外模型、组学技术、人工智能）正在不断推动该领域向前发展。体外皮肤致敏评估代表了现代毒理学向更人道、更高效、更具机理洞察力的方向迈进的坚定步伐，为保障消费者安全和促进产品创新奠定了坚实的科学基础。

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