超氧化物歧化酶（SOD）同工酶活性测定

超氧化物歧化酶（SOD）同工酶活性测定：从选择性检测到功能解析

一、同工酶谱系与检测策略

1. SOD家族特征

2. 选择性检测原理

graph TD
A[样本前处理] --> B{抑制/激活策略}
B -->|2mM KCN处理| C[灭活Cu/Zn-SOD → 测Mn-SOD活性]
B -->|2%氯仿-乙醇处理| D[灭活Mn-SOD → 测Cu/Zn-SOD活性]
B -->|Heparin亲和柱| E[分离EC-SOD]

二、核心检测方法优化

1. 改良的PMS-NADH-NBT四氮唑法

反应体系（200μL） ：

操作流程：

1. 37℃预孵育反应混合液5min
2. 加入黄嘌呤氧化酶启动反应（终浓度0.1U/mL）
3. 560nm监测吸光度下降速率（ΔA/min）

活性计算：
SOD活性(U/mg prot) = [(ΔA₀-ΔAₛ)/ΔA₀] / (50%抑制所需酶量) × 稀释倍数

注：1个活性单位定义为抑制NBT还原50%的酶量

2. 差异抑制法同工酶定量

三、精准分离与功能分析

1. 亚细胞组分分离方案

2. 活性染色鉴定

非变性PAGE步骤：

graph LR
A[样本上样] --> B[10%凝胶电泳]
B --> C[浸泡于2.43mM NBT]
C --> D[避光孵育20min]
D --> E[0.028mM核黄素+0.3%TEMED]
E --> F[UV照射20min]
F --> G[透明背景+蓝色条带]

鉴定特征：

• Cu/Zn-SOD：Rf=0.35（靠近前沿）
• Mn-SOD：Rf=0.28
• EC-SOD：Rf=0.15（需肝素预处理去除）

四、临床样本分析方案

1. 氧化应激疾病标志物

2. 药物效应评估模型

• 抗氧化剂筛选：

  H₂O₂处理HepG2细胞 → Mn-SOD活性↑3倍示药物有效

• 放疗敏感性：

  肿瘤组织Mn-SOD活性<10 U/mg → 放疗响应率↑70%

五、关键技术陷阱与对策