谷胱甘肽（GSH）测定

谷胱甘肽（GSH）测定技术：从精准定量到功能解析

一、核心检测原理

1. 谷胱甘肽的氧化还原特性

2. 检测方法选择矩阵

graph LR
A[样本类型] --> B{检测目标}
B -->|总GSH| C[DTNB比色法]
B -->|GSH/GSSG比值| D[HPLC荧光检测]
B -->|空间分布| E[单细胞成像]

二、标准化操作流程

1. DTNB比色法（总GSH检测）

反应原理：

GSH + DTNB → GS-TNB（黄色）+ TNB⁻
λmax=412nm，ε=14,150 M⁻¹cm⁻¹

操作流程：

graph TB
A[样本裂解] --> B[4℃离心10,000g×15min]
B --> C[上清+DTNB试剂]
C --> D[37℃孵育5min]
D --> E[412nm测吸光度]

关键参数：

计算公式：
[总GSH] = (A412-A0) / (ε × l) × 稀释倍数

三、高精度GSSG检测方案

1. 双酶法HPLC定量（GSH/GSSG比值）

策略设计：

1. GSSG保护：2-vinylpyridine 阻断游离GSH（仅GSSG保留）
2. 酶法转化：
   GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺（谷胱甘肽还原酶催化）
3. 荧光检测：Ex=340nm/Em=460nm监测NADPH消耗速率

色谱条件：

计算：
GSSG浓度 = (ΔNADPH斜率) / (标准曲线斜率)
GSH/GSSG比值 = (总GSH-2×GSSG) / GSSG

四、创新检测技术

1. 活体动态监测技术

2. 质谱法联用方案

• LC-MS/MS法：
  m/z转换：GSH 308→179，GSSG 613→355
  同位素内标：¹³C₂-¹⁵N-GSH（增加定量精度）
• MALDI成像：
  组织切片 → NIMS涂层（纳米离子化表面）→
  空间分辨率达10μm（脑切片GSH梯度分析）

五、临床与科研应用

1. 疾病标志物临界值

2. 功能解析模型

• 抗氧化能力评估：

  HepG2细胞经H₂O₂刺激 →
  GSH/GSSG比值下降80% → 计算EC50值

• 药物毒性机制：

  对乙酰氨基酚中毒模型：
  GST酶活性 + GSH消耗速率预测肝毒性

六、实验陷阱与对策