凝胶过滤层析实验

凝胶过滤层析实验：从分离原理到精准纯化的全流程解析

一、技术原理与核心要素

1. 分子筛效应基础

分离机理：

graph LR
A[大分子] --> B[从凝胶颗粒间隙流出 Ve≈V₀]
C[小分子] --> D[进入凝胶孔道内 Ve≈Vt]
E[目标蛋白] --> F[选择性滞留 Ve=(V₀+Vt)/2]

2. 常用介质对比

二、实验操作全流程

1. 标准化操作程序

graph TB
A[凝胶处理] -->|溶胀| B[装柱]
B --> C[平衡]
C --> D[上样]
D --> E[洗脱]
E --> F[检测]
F --> G[再生保存]

**关键步骤参数**：
| **步骤**        | 技术要点                      | 参数要求             |
|-----------------|-----------------------------|---------------------|
| 凝胶溶胀         | 10倍体积缓冲液沸水浴1h        | 溶胀体积=柱体积×1.5  |
| 装柱            | 重力沉降+恒流泵加压           | 流速0.5mL/min       |
| 柱效测试         | 蓝葡聚糖2000上样（1-2%柱体积）| HETP≤2×dₚ(粒径)     |
| 上样            | 样本粘度≤缓冲液2倍            | 体积≤2%柱体积       |

2. 缓冲液优化指南

• 通用配方：
  20mM Tris-HCl + 150mM NaCl (pH7.4)

  需经0.22μm过滤并脱气

• 特殊需求：

  目标	添加试剂	作用机制
  防聚集	10%甘油+1mM DTT	维持蛋白稳定性
  离子互斥	500mM NaCl	抑制静电吸附
  络合金属离子	1mM EDTA	防止金属介导结合

三、分离效能提升策略

1. 分辨率优化模型

分离度公式：

Rs = [2×(Ve₁ - Ve₂)] / (W₁ + W₂)

优化杠杆：

• 柱长(L)↑ ：分辨率∝√L（建议L=60-100cm）
• 流速↓ ：0.1→0.5mL/min (HPLC级流速可达5mL/min)
• 粒径(dₚ)↓ ：Superdex 3μm粒径分辨率↑2倍（需耐压系统）

2. 洗脱曲线控制

四、应用场景与技术拓展

1. 典型应用案例

• 抗体纯化：

  Protein A纯化后 → Sephacryl S-200柱 → 去除聚集体（纯度>98%）

• 膜蛋白分离：

  增溶后上样Sepharose CL-6B柱 → 洗脱峰1收集膜蛋白复合体

• 分子量标定：

  标准蛋白	分子量(kDa)	洗脱体积(mL)
  甲状腺球蛋白	669	8.5
  过氧化氢酶	232	12.1
  牛血清白蛋白	67	16.3

2. 联用技术突破

• 与质谱联用：
  在线GFC-MALDI系统 → 直接分析复合体组分（分析时间<10min）
• 多维层析：
  IEX→GFC串联系统（样本损失率<5%）

五、故障排查指南