EMSA载体构建

发布时间：2025-06-14 14:33:26 阅读量：7 作者：生物检测中心

EMSA载体构建完整流程

一、 实验原理与目的

电泳迁移率变动实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是研究蛋白质与特定核酸序列（如启动子、增强子、转录因子结合位点等）相互作用的经典方法。其核心在于检测蛋白质结合后引起的核酸探针迁移率变化。

构建EMSA载体（也称为探针表达载体）的主要目的是高效、稳定地大量扩增目标DNA片段。直接从化学合成的寡核苷酸获取探针成本昂贵且得量有限。将包含目标结合位点的DNA片段（通常为150-300 bp，包含核心结合序列及其上下游侧翼序列）克隆到质粒载体中，利用大肠杆菌系统进行扩增，再通过限制性酶切或PCR方法切下目标片段作为探针，是更为经济和高效的选择。

二、 载体选择

选择合适的EMSA载体是构建成功的基础，需考虑以下关键因素：

  1. 高拷贝数： 优先选择起点支持高拷贝数的质粒（如pUC系列、pBluescript系列衍生的载体），能够在细菌中实现目标片段的高效扩增，提高探针产量。
  2. 多克隆位点（MCS）： 载体应具备包含多种常用限制性内切酶识别位点的MCS区域，以便灵活地将目标片段定向插入。
  3. 筛选标记： 必须包含有效的抗生素抗性基因（如Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol抗性），用于筛选含重组质粒的阳性克隆。
  4. 测序引物位点： MCS两侧应设计通用的正向和反向测序引物结合位点（如T7, T3, SP6, M13F, M13R等），便于后续对插入片段进行DNA测序验证。
  5. 无核酸酶污染： 确保载体本身不含核酸酶活性。

三、 目标DNA片段设计与获取

  1. 序列选择：
    • 确定研究的核心蛋白结合序列。
    • 在核心序列两端添加适当的侧翼序列（上下游各约50-150 bp）。侧翼序列应具有生物学意义（如来自天然启动子/调控区域），或使用通用、惰性的序列（如无关基因组DNA）。侧翼序列有助于维持结合位点的天然构象，有时对蛋白结合至关重要。
    • 长度控制： 最终片段长度建议在150-300 bp之间。过短可能导致结合信号弱或非特异性背景高；过长则可能增加非特异性结合，且在EMSA胶上迁移差异不明显。
    • 尽量避免片段内部存在与克隆策略所用限制酶相同的酶切位点。若存在，需在分子设计阶段解决（改变克隆策略或定点突变消除内部位点）。
  2. 序列获取方法：
    • PCR扩增： 若目标序列已知且来源于特定基因组DNA或cDNA模板，设计特异性引物进行PCR扩增。引物设计需考虑后续克隆策略（见下文）。
    • 人工合成： 对于完全人工设计的序列或较短片段（< 200 bp），可直接委托合成两条互补的长链寡核苷酸单链。退火后形成双链DNA片段（ds Oligo），两端可设计所需的限制酶粘性末端或TA克隆末端。对于较长片段（> 200 bp），可合成基因片段（Gene Fragment）。

四、 克隆策略

常用且高效的克隆方法主要有两种：

  1. 限制性内切酶酶切与连接（酶切连接法）：

    • 载体酶切： 根据选择的MCS位点，使用两种不同的限制性内切酶（产生粘性末端最佳）对载体质粒进行双酶切，使载体线性化并产生特定的粘性末端。酶切必须充分、完全，可通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收线性化载体片段，去除未切开或单切的质粒。
    • 插入片段末端处理：
      • PCR产物： 在引物5'端设计相应的限制性内切酶识别序列（注意：必须在酶切位点序列外侧添加3-6个保护碱基，确保酶能有效切割）。PCR扩增后，纯化产物，使用选定的两种限制酶进行双酶切，产生与载体匹配的粘性末端，纯化回收目标片段。
      • 合成ds Oligo或Gene Fragment： 合成时直接在片段两端设计好所需的特定限制酶粘性末端序列（同样需要保护碱基）。退火（ds Oligo）后或直接使用，通常无需酶切（除非片段内部存在问题位点需要切除）。
    • 连接反应： 将经酶切处理并纯化回收的线性化载体与目标插入片段，在DNA连接酶（通常是T4 DNA Ligase）作用下，按照适当的摩尔比（例如载体：插入片段 = 1:3 到 1:10）进行连接反应。连接条件（温度、时间）需优化。
    • 特点： 定向克隆，效率相对较高，适用于片段两端有不同酶切位点的情况。

  2. TA克隆（适用于PCR产物）：

    • 原理： Taq DNA聚合酶在进行PCR扩增时，会在PCR产物3'端非模板依赖性地添加一个突出的腺苷酸（A）。TA克隆载体（如pMD18-T, pGEM-T）的MCS经过特殊设计，其线性化末端带有一个突出的胸苷酸（T），可与PCR产物的A端互补配对。
    • PCR产物要求： 使用常规Taq酶（而非高保真酶）扩增，确保产物带3'-A突出端。否则需对纯化后的PCR产物进行加A尾处理（使用Taq酶和dATP）。
    • 载体处理： TA克隆载体已提前线性化并做好T末端。
    • 连接反应： 将带A末端的纯化PCR产物与TA克隆载体在T4 DNA Ligase作用下直接连接。
    • 特点： 操作简便快捷，无需考虑片段两端特定的限制酶位点，克隆效率较高。缺点是非定向克隆（插入方向随机），后续需通过菌落PCR或测序筛选正向插入的克隆。

选择建议： 若片段两端有合适的、不同的限制酶位点，且内部无干扰位点，优先选择酶切连接法进行定向克隆。若片段较短、缺乏合适限制位点或追求快速简便，可选择TA克隆，但需增加筛选正向克隆的步骤。

五、 重组质粒构建流程

  1. 连接反应体系建立： 按上述方法准备好载体和插入片段，按照DNA连接酶说明书设置连接反应体系（通常含连接缓冲液、ATP、连接酶、载体、插入片段），在适宜温度（通常16°C或室温）下反应数小时（如过夜）。
  2. 大肠杆菌感受态细胞转化：
    • 取出连接产物（或空载体作为阴性对照）。
    • 解冻高转化效率的化学感受态大肠杆菌细胞（如DH5α, TOP10）。
    • 将连接产物加入感受态细胞中，冰浴30分钟。
    • 42°C热激90秒（或按感受态细胞说明书操作）。
    • 迅速冰浴2-3分钟。
    • 加入适量无抗性LB培养基，37°C摇床复苏培养45-60分钟。
  3. 阳性克隆筛选：
    • 将复苏后的菌液均匀涂布于含有相应抗生素（如Ampicillin 100 μg/mL）的LB琼脂平板上。
    • 37°C倒置培养12-16小时，观察单菌落生长。
  4. 阳性克隆鉴定：
    • 菌落PCR（Colony PCR）： 挑取数个单菌落，直接用特异性引物（载体通用引物如M13F/M13R，或设计在插入片段外侧的引物）进行PCR扩增。阳性克隆应能扩增出预期大小的目标条带（等于或略大于插入片段本身）。此法快速初筛。
    • 质粒酶切鉴定： 挑取菌落PCR阳性的克隆，接种于含抗生素的LB液体培养基中摇菌培养过夜。使用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA。用当初克隆时切开载体的限制性酶（单酶切或双酶切）对重组质粒进行酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳检测：若为阳性重组子，酶切后应释放出一条与预期插入片段大小相符的条带（双酶切）或载体线性化条带+插入片段条带（单酶切）。
    • DNA测序验证（必需步骤）： 对酶切鉴定初步确认的阳性克隆质粒，使用载体MCS两端的通用测序引物进行DNA测序（双向测序）。将测序结果与设计的插入片段序列进行比对，必须100%吻合，确保序列无突变（特别是关键的结合位点）、插入方向正确（若采用定向克隆）。发现序列错误或方向错误时，需重新挑取其他克隆进行鉴定。

六、 探针制备

成功构建并验证无误的重组质粒（即EMSA载体/探针表达载体）可用于后续探针制备：

  1. 大规模质粒制备： 挑取测序验证无误的单菌落，接种于较大体积（如50-200 mL）含抗生素的LB培养基中培养过夜。使用质粒中量或大量提取试剂盒纯化获得高质量质粒DNA。
  2. 探针释放：
    • 限制性酶切法： 使用特定的限制性内切酶（通常在目标片段两侧的MCS中选择合适的位点，避免切开目标片段内部）对大量质粒进行酶切。琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收目的条带（即目标DNA探针片段）。此法可获得精确长度的探针，但回收步骤可能导致探针损失。
    • PCR法： 使用高保真DNA聚合酶，以纯化的重组质粒为模板，用设计在目标片段两侧的引物进行PCR扩增（引物应紧邻目标片段两端，避免扩增长度远大于片段本身）。琼脂糖凝胶电泳纯化回收特异性PCR产物作为探针。此法简便快捷，产量高，但需确保PCR保真度和特异性。
  3. 探针纯化与定量： 纯化回收的探针（无论酶切或PCR获得）需通过乙醇沉淀法或其他DNA纯化方法（如硅胶膜离心柱）进一步纯化，去除盐离子、酶、引物等杂质。使用紫外分光光度计（测量A260）或荧光染料法（如Qubit）准确测定探针浓度。
  4. 探针标记（可选）： EMSA探针通常需要标记（放射性的α-³²P或γ-³²P dATP/dCTP；非放射性的生物素、地高辛、荧光染料等）以便检测。标记可以在探针制备过程中进行（如在PCR扩增时掺入标记的核苷酸），或在探针制备完成后进行末端标记（如T4多核苷酸激酶磷酸化标记γ-³²P ATP）。

七、 注意事项

  1. 序列准确性： DNA测序验证是确保构建成功的绝对关键步骤。
  2. 克隆策略设计： 仔细设计引物和酶切位点，避免内部位点冲突。选择合适的克隆方法。
  3. 酶切效率： 确保限制性内切酶活性良好，酶切反应体系优化（如缓冲液、BSA、反应时间、温度），必要时进行酶切预实验或双酶切缓冲液兼容性检查。
  4. 连接效率： 优化载体与插入片段的摩尔比（通常插入片段摩尔数过量），连接酶活性及连接时间温度。
  5. 感受态细胞质量： 使用高转化效率的感受态细胞。
  6. 无菌操作： 转化、涂板过程严格无菌操作。
  7. 探针设计合理性： 目标片段长度、侧翼序列是否足够支持特异性结合。
  8. 探针特异性： 在EMSA实验中应设置合适的对照（如突变探针、冷竞争探针）验证结合的特异性。

结论

成功构建EMSA载体是进行高质量EMSA实验的先决条件。通过精心设计目标序列、选择合适的载体和克隆策略、严格执行分子克隆操作流程（包括连接、转化、筛选和必不可少的DNA测序验证），最终获得序列准确无误的重组质粒，为后续高效制备大量高纯度核酸探针奠定坚实基础。严谨的实验设计和操作是获得可靠EMSA结果的关键。