荧光素酶蛋白互作载体构建

发布时间：2025-06-14 14:28:22 阅读量：6 作者：生物检测中心
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荧光素酶互补实验载体构建技术与应用指南

摘要： 荧光素酶互补技术（如Split-Luciferase）是研究体内外蛋白质相互作用的强大工具。其核心在于将荧光素酶拆分为两个无活性的片段，分别与目标蛋白融合表达。当目标蛋白发生相互作用时，荧光素酶片段得以接近并重构活性，催化底物产生可检测的发光信号。本技术指南详细阐述了基于荧光素酶互补系统的蛋白互作载体构建原理、设计策略、实验步骤及关键技术要点，为研究者提供系统参考。

一、技术原理与载体选择

荧光素酶互补技术利用了荧光素酶（如Firefly Luciferase, Fluc）可被功能性拆分的特性：

  1. 核心酶拆分： 将完整的荧光素酶（如Fluc）在特定位点（如第398位氨基酸附近）切割，形成N端大片段（N-Luc, 通常包含约1-398位氨基酸）和C端小片段（C-Luc, 通常包含约399-550位氨基酸）。单独表达时，两个片段均无酶活性或活性极低。
  2. 蛋白融合与互补： 将待研究的两个目标蛋白（Protein A和Protein B）分别与N-Luc和C-Luc融合，构建融合表达载体（如构建质粒pXN-N-Luc和pXC-C-Luc）。
  3. 互作驱动重构： 当Protein A与Protein B在细胞（或体外体系）内发生特异性相互作用时，会促使N-Luc和C-Luc片段在空间上相互靠近。这种接近足以使断裂的荧光素酶重新折叠形成正确的三维结构，恢复其催化荧光素氧化的活性，产生生物发光信号（图1）。

二、载体系统设计要点

构建高质量的互补载体是实验成功的关键：

  1. 荧光素酶片段选择：

    • N-Luc片段： 通常较大（~40-45 kDa），包含大部分酶结构域。其长度和稳定性对背景信号有较大影响。
    • C-Luc片段： 较小（~10-15 kDa），包含关键的催化位点区域（如活性位点残基）。
    • 优化考虑： 需平衡片段大小（影响空间位阻和互补效率）与稳定性（影响背景信号）。有时需要尝试不同的拆分点或使用经过优化的工程化片段组合以降低背景、提高灵敏度。

  2. 目标蛋白（POI）融合方式：

    • 末端融合： 最常见的方式，直接将POI的N端或C端与荧光素酶片段的C端或N端相连（如POI-N-Luc, POI-C-Luc）。需决定哪个POI融合N-Luc，哪个融合C-Luc（有时需要进行预实验筛选最优组合）。
    • 接头（Linker）： 至关重要！在两个融合部分之间加入一段柔性氨基酸接头（如(GGGGS)n, n=2-5）。接头的作用是：
      • 减少空间位阻，允许POI和荧光素酶片段各自灵活折叠。
      • 增加融合蛋白的溶解度。
      • 提高互补效率。接头的长度和序列需要优化。

  3. 表达载体框架：

    • 启动子: 根据研究体系选择（如CMV启动子用于哺乳动物细胞组成型表达；组织特异性或诱导型启动子用于特定需求）。
    • 筛选标记： 用于稳定转染细胞系的筛选（如Neomycin/G418, Puromycin, Hygromycin等）或质粒扩增（如Ampicillin, Kanamycin等）。
    • 报告基因/标签： 可考虑引入额外的报告基因（如荧光蛋白EGFP, mCherry）或标签（如HA, FLAG, Myc），用于：
      • 验证融合蛋白表达。
      • 检测转染效率。
      • 进行免疫共沉淀（Co-IP）/Western Blot等后续验证实验。
    • 多克隆位点（MCS）： 应包含常用的单一酶切位点，便于POI的克隆插入。

三、载体构建实验流程

  1. 目的基因（POI）扩增：

    • 设计特异性引物，从cDNA文库或现有载体中PCR扩增目标蛋白A（POI-A）和蛋白B（POI-B）的编码序列。
    • 引物5’端需引入选定的酶切位点和保护碱基（与载体MCS兼容），3’端需引入与互补荧光素酶片段（N-Luc或C-Luc）相连所需的酶切位点和/或Linker序列（或Linker已在载体上）。
    • 进行高保真PCR，胶回收纯化目标条带。

  2. 骨架载体准备：

    • 获取或构建包含Split-Luc片段（N-Luc或C-Luc）的表达载体骨架（如pXN-N-Luc, pXC-C-Luc）。
    • 用相应的限制性内切酶对载体进行双酶切（与POI插入片段两端酶切位点一致），充分线性化载体并进行去磷酸化处理（减少自连）。
    • 胶回收纯化线性化载体片段。

  3. 连接反应：

    • 将纯化后的POI-A片段与线性化的pXC-C-Luc载体连接（构建POI-A-C-Luc）。
    • 将纯化后的POI-B片段与线性化的pXN-N-Luc载体连接（构建POI-B-N-Luc）。
    • 使用高效的DNA连接酶（如T4 DNA Ligase），在适宜温度（通常16°C）下孵育足够时间（如过夜）。
    • 对照构建： 同时构建阴性对照载体（如POI-A-C-Luc + 空N-Luc载体；POI-B-N-Luc + 空C-Luc载体；POI-A-C-Luc + 无关蛋白B’-N-Luc）。

  4. 转化与克隆筛选：

    • 将连接产物转化入感受态细胞（如DH5α）。
    • 涂布于含相应抗生素的LB琼脂板上培养过夜。
    • 挑取单菌落进行小量培养。
    • 使用菌落PCR或酶切鉴定初步筛选阳性克隆。

  5. 质粒提取与测序验证：

    • 对初步筛选阳性的克隆进行质粒小抽。
    • 关键步骤： 对构建的重组质粒进行双酶切验证（观察片段大小是否正确）和全基因序列测序（确认POI序列、Linker序列、荧光素酶片段序列及其连接处序列完全无误）。

四、关键技术要点与优化策略

  1. 片段拆分位点与组合： 选择经过验证的、互补效率高且背景低的拆分位点片段对。N-Luc/C-Luc是常用组合，也可尝试其他优化变体。
  2. Linker设计与优化： Linker是成功的关键变量。优先选用柔性Linker（如(GGGGS)n）。Linker长度（通常在10-25个氨基酸）需优化，过短可能导致空间位阻，过长可能增加非特异性聚集风险。必要时可尝试不同Linker序列。
  3. 融合方向： POI的N端或C端融合哪个荧光素酶片段会影响互补效率。若无先验知识，建议尝试所有四种组合（POI-A-N-Luc + POI-B-C-Luc; POI-A-C-Luc + POI-B-N-Luc; POI-A-N-Luc + POI-B-N-Luc？[通常不可互补]； POI-A-C-Luc + POI-B-C-Luc？[通常不可互补]）进行初步筛选。通常推荐POI融合在荧光素酶片段的N端或C端均可，但需测试。
  4. 表达水平均衡： 两个融合蛋白的表达水平不平衡会显著影响信号强度和背景。可通过Western Blot检测表达量，优化转染比例或选择表达强度匹配的载体/启动子。
  5. 严格的阴性对照： 必须设置充分的对照！
    • 单独表达对照： 单独转染POI-A-C-Luc + 空载体；POI-B-N-Luc + 空载体（检测每个融合蛋白单独表达时的背景信号）。
    • 无关蛋白对照： POI-A-C-Luc + 确认与POI-A无关的蛋白X-N-Luc（检测POI-A的非特异性互作）。
    • 突变体对照： 如果已知互作关键结构域，使用突变体POI构建载体作为阴性对照。
    • 溶剂对照： 体外实验需设置添加溶剂的对照。
  6. 阳性对照： 使用已知相互作用的蛋白对（如Fos/Jun）构建的互补载体作为阳性对照，验证整个实验系统的有效性。
  7. 剂量依赖性实验： 在一定范围内，发光信号强度应随表达相互作用的融合蛋白的数量增加而增强，这是互作特异性的重要佐证。

五、应用与验证

构建成功的Split-Luc载体主要用于：

  1. 体内蛋白互作检测： 将载体共转染入哺乳动物细胞、植物细胞、酵母或模式生物（如线虫、斑马鱼）中，通过检测裂解液或活体内的生物发光信号强度来定量分析蛋白互作。
  2. 体外蛋白互作检测： 在无细胞系统（如兔网织红细胞裂解液）中表达融合蛋白，或纯化融合蛋白后在体外混合，再加入底物检测发光。
  3. 互作强度定量与动力学分析: 发光信号强度可相对定量互作强弱。结合药物处理或条件改变，可研究互作的动力学或调控。
  4. 互作结构域/关键残基定位： 构建目标蛋白的不同截短体或点突变体进行融合表达，筛选影响互作的关键区域。
  5. 高通量筛选： 适用于筛选干扰或促进特定蛋白互作的小分子化合物或siRNA/shRNA。

重要验证： Split-Luc检测到的发光信号强烈提示空间接近和潜在互作，但不能等同于直接的物理结合。结果应通过其他独立的生物物理学或生化方法进行验证，如：

  • 免疫共沉淀（Co-IP）或Pull-down + Western Blot： 验证体内/外物理结合。
  • 表面等离子体共振（SPR）、微量热泳动（MST）、等温滴定量热（ITC）： 测定结合动力学和亲和力。
  • 荧光共振能量转移（FRET）、生物发光共振能量转移（BRET）： 在活细胞中验证纳米尺度的空间接近（BRET与Split-Luc原理不同）。
  • 酵母双杂交（Y2H）： 经典的双杂交方法。
  • 交联质谱（XL-MS）： 鉴定互作界面。

六、总结

荧光素酶互补技术载体构建是一项精密而关键的工作。成功的关键在于严谨的分子克隆操作、合理的载体设计（特别是Linker和融合方向）、充分的对照设置以及对实验结果的多维度验证。该技术凭借其高灵敏度、操作相对简便、可进行活体或高通量检测等优势，已成为蛋白质相互作用研究领域不可或缺的工具。通过遵循本指南的设计原则和实验流程，研究者能够构建出可靠有效的Split-Luciferase互作载体，为深入探索生命过程中的蛋白互作网络提供有力支持。

参考文献：

  1. Paulmurugan, R., & Gambhir, S. S. (2003). Monitoring protein-protein interactions using split synthetic renilla luciferase protein-fragment-assisted complementation. Analytical chemistry, 75(7), 1584–1589.
  2. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., & Piwnica-Worms, D. (2004). Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(33), 12288–12293.
  3. Stefan, E., Aquin, S., Berger, N., Landry, C. R., Nyfeler, B., Bouvier, M., & Michnick, S. W. (2007). Quantification of dynamic protein complexes using Renilla luciferase fragment complementation applied to protein kinase A activities in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(43), 16916–16921.
  4. Dixon, A. S., Schwinn, M. K., Hall, M. P., Zimmerman, K., Otto, P., Lubben, T. H., ... & Wood, K. V. (2016). NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS chemical biology, 11(2), 400–408. (注：介绍NanoLuc技术的优化应用)
  5. 分子克隆实验指南（第四版） (Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular cloning: a laboratory manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.)

（附图：荧光素酶互补技术原理示意图）

  • 图示说明：
    • (A) 完整荧光素酶催化荧光素氧化产生光信号。
    • (B) 荧光素酶被拆分为N端片段(N-Luc)和C端片段(C-Luc)，单独表达时无活性或活性极低。
    • (C) 目标蛋白A(Protein A)与C-Luc融合(Protein A-C-Luc)。目标蛋白B(Protein B)与N-Luc融合(Protein B-N-Luc)。当Protein A和Protein B不相互作用时，N-Luc和C-Luc无法互补，无发光信号。
    • (D) 当Protein A和Protein B特异性相互作用时，将N-Luc和C-Luc拉近，使其能够正确折叠并恢复荧光素酶活性，催化底物产生可检测的发光信号。连接Protein A/B与Luc片段的柔性接头(Linker)在图中标示。