GST Pull-Down载体构建完整方案
一、 实验核心原理
利用谷胱甘肽巯基转移酶（GST）对谷胱甘肽（GSH）的高亲和力，将GST-诱饵蛋白固定在GSH亲和填料上作为“诱饵”，捕获溶液中的“猎物”蛋白。
二、 载体构建关键步骤
(一) 载体选择标准
- 表达系统兼容性： 选用支持目的蛋白表达的载体（原核常用大肠杆菌系统）
- 多克隆位点（MCS）： 位于GST标签下游，包含多种稀有酶切位点
- 启动子强度： 选用强启动子（如T7、tac）提升表达效率
- 抗生素抗性： 根据实验系统选择相应抗性基因（如Amp⁺、Kan⁺）
(二) GST融合标签设计
- 位置设计： GST标签通常位于诱饵蛋白N端
- 连接序列： 包含蛋白酶切割位点（如PreScission、TEV、Thrombin）
- 终止密码子： GST序列后需添加终止密码子（用于空载体对照）
(三) 目的基因克隆
- 引物设计：
- 5'端引入载体MCS中限制性内切酶位点
- 3'端引入另一互补酶切位点（或终止密码子）
- 保持诱饵蛋白正确读码框
- PCR扩增： 高保真酶扩增目的基因片段
- 双酶切： 同步酶切PCR产物与载体骨架（37℃, 2小时）
- 纯化连接： 胶回收酶切产物，T4 DNA连接酶16℃连接过夜
- 转化筛选： 将连接产物转化感受态细胞，涂布含抗生素平板
- 阳性鉴定：
- 菌落PCR验证插入片段大小
- 限制性酶切鉴定
- 测序确认读码框准确性
三、 表达验证与优化
- 小试表达：
- 挑取阳性克隆接种于含抗性LB培养基
- IPTG诱导表达（优化浓度：0.1-1.0mM；温度：16-30℃；时间：4-16小时）
- SDS-PAGE检测：
- 全细菌裂解液电泳分析
- 观察预期分子量处条带（GST约26kDa + 诱饵蛋白分子量）
- 对比空载体对照（仅26kDa GST条带）
- 可溶性分析：
- 超声破碎细菌沉淀
- 离心分离上清（可溶部分）与沉淀（包涵体）
- 分别进行SDS-PAGE，确定融合蛋白溶解状态
四、 技术难点与解决方案
五、 实验对照设置（关键！）
- GST空载体对照： 排除GST标签自身结合
- 未诱导细菌裂解液： 排除细菌蛋白干扰
- 突变诱饵蛋白对照： 验证相互作用特异性
- BSA封闭对照： 验证非特异性吸附背景
六、 重要注意事项
- 标签干扰验证： GST标签可能影响诱饵蛋白活性，建议通过功能实验验证
- 内源蛋白干扰： 原核系统缺乏翻译后修饰，需警惕真核蛋白的错误折叠
- 文库兼容性： 当用于筛选文库时，需预先测试载体系统兼容性
- 标签去除必要性： 若GST影响互作，可通过蛋白酶切割去除标签后重复实验
结论 GST Pull-down载体构建是互作研究的基础环节，严谨的载体设计、精准的克隆策略以及系统的表达优化可显著提升实验成功率。后续结合严谨的对照设置和条件优化，将为蛋白质相互作用研究提供可靠支持。