Co-IP载体构建

发布时间：2025-06-14 14:24:46 阅读量：8 作者：生物检测中心

Co-IP载体构建技术指南

一、 技术原理

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是研究蛋白质相互作用的经典方法。其核心在于利用特异性抗体捕获靶蛋白（诱饵蛋白）及其在生理条件下相互作用的蛋白（猎物蛋白）。Co-IP载体构建是为该技术量身定制分子工具的关键步骤，通过在目标蛋白编码序列上融合特定表位标签（Epitope Tag），实现高效、特异的免疫沉淀。

二、 核心要素：载体与标签选择

  1. 表达载体选择：

    • 启动子： 依据研究体系（哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌等）选择强效且调控合适的启动子（如CMV、EF1α、GAL1等）。
    • 筛选标记： 包含抗生素抗性基因（如嘌呤霉素、新霉素/G418、潮霉素抗性基因）或其他筛选标记（如营养缺陷型互补基因），用于稳定转染细胞系的筛选。
    • 起点： 适用于宿主细胞的起点（如哺乳动物细胞中的SV40 ori）。
    • 融合标签位置： 载体需提供灵活的克隆位点，便于在目标蛋白的N端或C端融合标签。

  2. 表位标签选择（关键）：

    • 常用标签：
      • FLAG: 短肽（DYKDDDDK），高特异性抗体，温和洗脱条件（EDTA或FLAG肽竞争），背景低。
      • HA: 流感血凝素表位（YPYDVPDYA），抗体特异性好，应用广泛。
      • Myc: 原癌基因产物表位（EQKLISEEDL），抗体易得，但需注意内源性Myc表达干扰。
      • V5: 猿猴病毒5表位（GKPIPNPLLGLDST），高亲和力抗体。
      • His: 多聚组氨酸（通常6xHis），主要用于固定化金属亲和层析纯化，也可用于特定条件下的Co-IP（需高纯度、高亲和力抗体），成本低。
    • 选择考量：
      • 抗体特异性与亲和力： 首选配套抗体特异性强、背景低、经过Co-IP验证的标签。
      • 宿主系统： 避免内源性蛋白含有相同标签。
      • 标签大小与位置： 小标签（如FLAG, HA）对目标蛋白干扰较小。N端或C端的选择需考虑目标蛋白的结构功能域（避免掩盖相互作用界面或重要功能域）和亚细胞定位信号。
      • 下游应用： 是否需进行蛋白洗脱（FLAG标签最方便）、串联纯化等。

三、 载体构建操作流程

  1. 目标基因克隆：

    • 通过PCR从cDNA或基因组DNA中扩增目标蛋白编码序列。
    • 引物设计：
      • 引入与载体克隆位点匹配的限制性酶切位点（或同源重组接头）。
      • 如需去除终止密码子（构建C端标签载体时）。
      • 如需添加柔性连接肽（Linker，如Gly-Ser重复序列），连接标签与目标蛋白，增加空间灵活性。
      • 精确设计，避免移码突变。
    • PCR产物纯化、酶切（若使用限制性内切酶克隆法）。

  2. 载体准备：

    • 选择含有目标表位标签的合适表达载体。
    • 使用相应限制性内切酶对载体进行线性化（若使用酶切连接法）。
    • 载体纯化（去除酶切缓冲液，避免抑制连接）。

  3. 连接/重组：

    • 限制性内切酶连接法： 将酶切后的PCR片段与线性化载体在DNA连接酶作用下连接。
    • 同源重组克隆法（推荐）： 利用线性化载体与带有同源臂的PCR片段在重组酶作用下进行无缝连接，效率高，不受酶切位点限制。
    • Gibson组装法等： 其他高效的体外DNA组装方法。

  4. 转化与筛选：

    • 将连接/重组产物转化入感受态细胞（通常为大肠杆菌）。
    • 在含相应抗生素的平板上筛选阳性克隆。

  5. 阳性克隆鉴定：

    • 菌落PCR： 快速筛选插入片段大小正确的克隆。
    • 质粒提取与酶切鉴定： 通过限制性酶切图谱验证插入方向和片段大小。
    • DNA测序（必需）： 最终确认目标基因序列、标签序列、阅读框完全正确，无突变。

四、 构建策略与注意事项

  1. N端 vs C端标签：

    • N端标签： 保留目标蛋白C端序列，利于包含天然终止子和下游调控元件。可能干扰N端信号肽或功能域。
    • C端标签： 保留N端信号肽等序列。需确保PCR时去除天然终止密码子。可能干扰C端功能域或定位信号。
    • 策略： 通常在未知关键功能域位置时，可尝试构建两种形式进行验证。

  2. 连接肽（Linker）：

    • 目的：在标签与目标蛋白之间引入柔性氨基酸链，减少标签对目标蛋白折叠和相互作用的潜在空间阻碍。
    • 常用序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n（n通常为3-5）。
    • 位置：位于标签和目标蛋白之间。

  3. 蛋白酶切割位点：

    • 目的：在标签与目标蛋白之间引入特异性蛋白酶（如TEV蛋白酶、PreScission蛋白酶、凝血酶、Factor Xa）识别位点，便于在纯化后去除标签，获得接近天然状态的目标蛋白（尤其适合后续结构或功能研究）。
    • 考虑：切割效率、特异性、成本、是否需要去除蛋白酶等。

  4. 对照载体构建：

    • 空载体对照： 仅含标签的表达载体，用于评估标签本身非特异性结合导致的背景。
    • 突变体对照： 关键功能域突变的目标蛋白载体，用于验证相互作用的特异性。

五、 结果验证与应用

  1. 瞬时/稳定转染与表达验证：

    • 将构建好的载体转染目标细胞。
    • 通过Western Blot（WB）使用标签特异性抗体和靶蛋白抗体（若有），检测融合蛋白是否正确表达及大小是否符合预期。

  2. Co-IP实验验证：

    • 用标签抗体进行免疫沉淀。
    • WB检测：a) 标签抗体（验证沉淀效率）；b) 目标蛋白抗体（验证沉淀正确性）；c) 已知或候选相互作用蛋白的抗体（评估相互作用）。
    • 设置严格的对照（空载体、未转染细胞等）。

  3. 应用策略：

六、 常见问题与优化

  • 表达水平过低： 尝试更换启动子；优化转染条件；检查载体是否整合入基因组（稳定株）。
  • 蛋白降解： 在裂解缓冲液中添加足量蛋白酶抑制剂混合物；优化实验流程，保持低温操作。
  • 背景高/非特异结合： 优化裂解缓冲液和洗涤缓冲液的盐浓度、去垢剂种类和浓度；使用预清除步骤（加入Protein A/G磁珠/琼脂糖）；尝试不同标签抗体；确保充分的洗涤次数和强度。
  • 未检测到相互作用： 确认融合蛋白正确表达且标签可及；尝试不同标签位置；检查相互作用是否依赖于特定条件（如激活状态、亚细胞定位、翻译后修饰）；考虑使用更灵敏的检测方法。
  • 假阳性相互作用： 严格设置对照（空载体、无关蛋白标签）；注意死后相互作用问题（裂解后非生理性结合），强调在细胞裂解前维持生理状态的重要性。

总结：

Co-IP载体构建是Co-IP实验成功的前提。精心选择表位标签和表达载体，精确设计并克隆目标基因，构建N端或C端融合的标签蛋白表达载体，并进行充分的验证，才能为后续高效、特异地捕获蛋白质相互作用提供可靠的工具。理解构建策略中的关键考量点（如标签位置、连接肽、切割位点）和潜在问题，并进行针对性优化，是获得可靠Co-IP结果的重要保障。