免疫共沉淀（Co-IP）

一、技术原理与核心价值

分子互作捕获机制

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）基于抗原-抗体特异性结合原理，结合亲和纯化技术解析蛋白质相互作用网络：

• 第一步：抗体-靶蛋白（诱饵蛋白）结合形成免疫复合物
• 第二步：通过Protein A/G偶联微球捕获复合物
• 第三步：洗脱获得互作蛋白（猎物蛋白）
• 分辨率：可检测KD=10⁻⁶~10⁻⁹ M的中等亲和力相互作用

技术优势矩阵

二、标准化操作全流程

1. 关键实验试剂配置

graph LR  
A[细胞裂解液] --> B[NP-40裂解体系]  
B --> C[蛋白酶抑制剂cocktail]  
C --> D[磷酸酶抑制剂（NaF/β-甘油磷酸酯）]  
D --> E[核酸酶（Benzonase®）]  

裂解液优化配方：
50mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1mM EDTA, 10% glycerol, 1mM DTT

2. 抗体微球复合物制备

3. 免疫沉淀操作程序

Day1：  
  1. 样本裂解（4℃旋转裂解30min）  
  2. 12,000g离心除碎片（4℃, 15min）  
  3. 取1mg总蛋白 + 抗体微球复合物  
  4. 4℃旋转孵育过夜  

Day2：  
  5. 500g离心收集微球（4℃, 5min）  
  6. 冷裂解液洗涤4次（每次5min）  
  7. 低pH甘氨酸洗脱（pH2.5, 10min）或直接上样缓冲液煮样  

三、技术创新与瓶颈突破

亲和基质升级

特异性增强策略

• 串联标签系统：
  • FLAG-HA双标签（特异性＞99%）
  • 顺序洗脱降低假阳性
• CRISPR/Cas9内源标记：
  • HiBiT标签（11aa）实现内源蛋白检测
• 对照设计：
  • IgG同型对照 + 敲除细胞阴性对照

低丰度蛋白捕获

策略：  
  1. 甲醛交联（0.1-1%处理10min）稳定瞬时互作  
  2. 邻近标记（TurboID/BioID）标记互作蛋白  
  3. 信号放大（Tyramide-Click）检测飞克级蛋白  
验证：  
  Co-IP/WB检测限达0.1ng（常规WB的100倍）  

四、互作验证与数据分析

1. 阳性结果确认方法

2. 质谱数据分析流程

import pandas as pd  
# MaxQuant结果处理  
raw_data = pd.read_csv('proteinGroups.txt', sep='\t')  
# 筛选高置信互作蛋白  
high_conf_interactors = raw_data[  
    (raw_data['LFQ intensity'] > 1e5) &   
    (raw_data['Reverse'] != '+') &  
    (raw_data['Potential contaminant'] != '+')  
]  
# SAINT算法验证（FDR<0.01）  

3. 互作网络可视化

Cytoscape构建核心互作图谱：

• 节点直径：蛋白表达量
• 连线粗细：互作强度
• 颜色梯度：功能聚类

五、应用场景与前沿突破

疾病机制研究

• 肿瘤信号通路：
  • EGFR-Co-IP鉴定HER3为耐药新靶点（Nature 2023）
• 神经退行疾病：
  • Tau蛋白互作组发现泛素连接酶TRIM11（Science 2022）

药物开发应用

合成生物学应用

• 人工蛋白质电路：
  • Co-IP验证合成Notch受体正交性（Cell 2023）

六、操作陷阱与解决方案

七、标准化操作规范（SOP）

关键质控节点

1. 裂解效率：
   • Bradford检测蛋白浓度 > 2mg/mL
   • DNA残留 < 5%（A260/A280 < 0.8）
2. 抗体有效性：
   • 效价测试：1μg抗体沉淀≥100ng靶蛋白
3. 实验记录要求：

   参数	记录标准
   微球批号	精确至单批次
   洗涤体积/次数	≥4次×500μL
   洗脱pH值	精密试纸检测（pH±0.1）

结论：从分子互作到精准调控

免疫共沉淀技术正向三大方向发展：

1. 超高分辨率：Cryo-EM联用解析复合物原子结构
2. 单细胞水平：微流控芯片实现单细胞Co-IP
3. 人工智能化：DeepPocket算法预测互作界面