蛋白质免疫印迹（Western Blot）

蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术全流程解析与精准诊断应用

从电泳分离到抗体识别的分子检测金标准

一、技术原理与核心价值

分子检测的基石

蛋白质免疫印迹（Western Blot, WB）基于抗原-抗体特异性结合原理，通过三个阶段实现对目标蛋白的定性与半定量分析：

1. 电泳分离：SDS-PAGE按分子量分离蛋白质混合物（分辨率达1kDa）
2. 膜转移：电场驱动蛋白从凝胶转印至PVDF/硝酸纤维素膜（转移效率>95%）
3. 免疫检测：抗体-酶偶联物催化底物显色/发光（检测限0.1-1ng）

不可替代的技术优势

二、标准化操作全流程

1. 样本制备关键点

graph TB
A[细胞/组织] --> B[裂解缓冲液]
B --> C[离心去除碎片]
C --> D[定量调整浓度]

• 裂解液配方（RIPA改良型）：
  50mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.25%脱氧胆酸钠, 1mM EDTA, 蛋白酶抑制剂x1
• 浓度控制：
  20-30μg总蛋白/孔（BCA法定量CV<5%）

2. SDS-PAGE电泳优化

3. 蛋白转印技术突破

• 膜材料选择：
  PVDF膜： 结合能力强（150μg/cm²），需甲醇激活
硝酸纤维素膜： 适用低分子量蛋白（<15kDa），免激活
• 转印参数：
  plaintext
  

  湿转法： 100V恒定电压，4℃转印60分钟（冰浴循环）
  半干转： 2.5mA/cm²恒定电流，转印30分钟

• 效率验证：
  丽春红S染色确认Marker完全转移

三、免疫检测创新系统

抗体孵育体系

[封闭] 5%脱脂牛奶/TBST，室温摇动1h  
[一抗] 稀释于封闭液，4℃过夜（抗人GAPDH 1：2000）  
[洗涤] TBST 10min×3次  
[二抗] HRP偶联抗体（1：5000），室温1h  
[增强] ECL化学发光底物曝光

关键优化：

• 膜切割：多目标检测时按分子量切条带
• 微波修复：抗原表位暴露（中火600W处理5分钟）

检测灵敏度革命

四、数据分析与问题排错

定量分析方法

相对表达量 = 目标条带灰度值 ÷ 内参条带灰度值
验证方法：

• 内参选择：GAPDH/β-actin（胞质），Lamin B1（核蛋白）
• 软件推荐：Image Lab™ 6.0（支持背景扣除和泳道校正）

常见问题解决方案